缺氧肺血管收缩(HPV)是一种重要的生理现象,通过它,在肺气孔缺氧与通气匹配。促成HPV的主要血管部分是血管内动脉。在这里,我们描述了我们的方案,分析直径为20-100微米的murine肺血管的HPV。
急性肺缺氧导致肺血管收缩(HPV),也称为冯·欧拉-利耶斯特兰德机制,用于将肺灌注与通气相匹配。到目前为止,基本机制尚未完全了解。促成HPV的主要血管部分是血管内动脉。此血管部分负责单个阿辛斯的血液供应,该支气管被定义为肺部分流到末期支气管的部分。腹内动脉大多位于肺部的这一部分,许多常用技术(如在孤立的灌注肺中测量肺动脉压力或从解剖的近肺动脉段1,2中强制记录)无法选择性地到达。通过实时共聚焦激光扫描发光显微镜对子体容器的分析仅限于直径达50μm的3型血管。
我们提供一种技术来研究20-100微米内径范围内的肺内动脉的HPV。它基于精确切肺切片 (PCLS) 中横截面动脉的视频形态分析。这种方法允许定量测量内径在20-40μm之间的小 血管内部 动脉的血管活性,这些动脉位于柱状管旁的紫外体隔膜的谷类中,以及内径在40-100μm之间的较大 前动脉 ,这些动脉与支气管和支气管相邻。与麻醉和通风小鼠的子膜血管的实时成像相比,PCLS 的成像分析是在无剪切应力的条件下进行的。在我们的实验模型中,两个动脉段在暴露于1%O2 的中等气体中时都表现出单相HPV,在缺氧30-40分钟后反应减弱。
在大多数全身血管床中,缺氧诱发血管扩张,与肺血管缺氧引起的血管收缩相比。这种针对肺部特异性对降低氧张力的反应称为缺氧肺血管收缩(HPV),在几秒钟内发病,切换回正常氧通气后迅速逆转。虽然HPV已知超过60年,但导致血管收缩的细胞氧传感器和信号级联仍在争论之中。有一个相对广泛的共识,缺氧引起红氧化物和ROS的变化是必不可少的HPV和肺高血压的发展(在西尔维斯特 等人审查。4 和 舒麦克 等人。5)) 我们自己的数据支持线粒体呼吸链复杂II在HPV6,7中的中心作用。最近,王 等人提出了一个全新的氧气感应和HPV概念:根据他们的数据,他们提出,心室缺氧是由相邻的毛细管感应导致内皮细胞膜去极化。反应通过内皮细胞的连接40间隙交汇点传播,导致上游动脉8的平滑肌肉细胞收缩。
肺动脉沿着气道运行,与气道一起分支,直径不断减少,最后向位于肺壁的毛细血管系统供血。这种动脉循环由解剖学和功能上不同的部分组成。近部导管动脉的特点是壁内有丰富的弹性纤维,然后是完全肌肉化的肺内动脉,主要控制肺血管阻力。分步,这些动脉进入肌肉层不完整的部分,最后血管没有光滑的肌肉活性免疫细胞。用血液喂养单个肺癌的癌内动脉代表部分肌肉部分6。同样,肺动脉系统并不代表低氧反应的均匀结构,但表现出明显的区域多样性9,10。例如,在从大鼠肺缺氧中分离出的近邻肺动脉会引起双相反应,显示短时间的初始快速收缩,在完全放松后,随后是第二次缓慢但持续收缩的11。在从大鼠肺肺痛中分离出的抗性动脉中,作为肺动脉的第四和第五分裂(外径<300微米),缺氧导致单相收缩9。早在1971年,格拉齐尔和穆雷就从用低氧气体混合物通风的狗肺毛细血管红细胞浓度变化的测量结果得出结论,缺氧引起的血管抵抗力增加主要发生在毛细血管12的上游。如今,麻醉和机械通风小鼠完整肺部的内在显微镜是分析肺微血管13,14的有力工具。胸壁上圆形窗户的切除使肺表面具有微观的可访问性,并允许对直径高达 50μm 的胸腔下肺血管进行分析。通过将这项技术与FITC-德克斯特兰、塔布奇 等人的输液相结合。表明只有直径为30-50μm的中型动脉对缺氧有显著反应,缺氧持续60分钟,30分钟后轻微衰减。相比之下,直径为20-30μm的小动脉对缺氧3只表现出轻微的反应。然而,这种技术不允许分析直径大于50μm的动脉,因为这些血管位于肺组织太深。
为了弥合对穆林肺大肺和非常小肺动脉(如下胸血管)的分析差距,我们采用了马丁 等人描述的方法。用于分析气道15的自反应。基于一种糖凝胶灌输技术,它有助于从这种相对柔软和弹性的器官中精确切肺片 (PCLS) 的制备。在内径在20-100微米的横断面动脉的PCLS血管内,可以通过显微镜直接观察。在 PCLS 的低氧潜伏期间应用药物,可以分析其对 HPV 的影响。这种技术还特别重要,可以应用于基因工程小鼠。根据动脉在肺部的位置,我们将动脉分类为癌前血管和癌内血管,其内径分别为20-40微米和40-100微米。在功能视图下,血管内动脉为单个肺癌提供血液,癌前动脉是前血管部分。在数码相机上录制图片可以随后对血管功能进行量化。这种 PCLS 模型的一个明显属性是缺乏对内皮作用的剪切应力。相比之下,在灌注容器中,急性HPV会导致剪切应力增加,从而诱导二级机制,如NO释放16。此外,使用 PCLS 可以测量 HPV,而不会对肺外神经或荷尔蒙产生影响。与细胞培养系统相比,例如由犬肺动脉平滑肌细胞17制备的细胞培养,血管壁的组织结构几乎完全保存下来。
总之,该协议为分析潜在的分子氧传感器和/或细胞通路提供了一个有用的方法,这些通道负责在无剪切应力条件下,内径在20-100 μm之间的肺内动脉的HPV。
分离通风和灌注小鼠肺是分析肺血管系统对氧气供应变化的生理反应的极好模型,允许连续测量肺动脉压力1。然而,该模型不允许识别和分析这些血管段(s)显示对缺氧的最强反应。这是我们对PCLS的视频形态分析的优势,它有助于测量内径为20-100微米的单个动脉的HPV。 PCLS代表着一个有吸引力 的体外 模型,因为它们与它们所准备的器官非常相似。与细胞培养系统相比,所有细胞类型都存在于其原始组织基质配置中。此外,一个肺足以准备许多PCLS,以便至少部分实验可以通过使用来自同一小鼠的部分进行标准化。根据罗素和伯奇23 的3R概念(生命科学中实验室动物的减少、精炼和替代),这一事实也主张使用PCLS。
然而,我们必须记住,组织被破坏,通过切割与振动和纵向信号,例如通过内皮细胞,由Kübler 等人假设。14 不再可能。
最初,PCLS主要应用于生化、药理学和毒理学研究,但同时它们也用于测量支气管收缩、粘膜功能和血管反应(请参阅桑德森20 和戴维斯21)。举行 等人。他们进行了一项研究,比较了分离香水和通风小鼠肺和PCLS24的模型。他们通过分析气道和肺血管对各种内源介质的反应,发现整个肺的重要特征在PCLS中得以保持。
在PCLS中,低氧条件不是通过气道建立的,而是通过在低氧气中孵化肺部。我们使用血液气体分析仪分析了中等气的氧气部分压力(pO2),分别为1%O 2、5.3%CO2、93.7%N 2和21%O2、5.3%CO2、73.7%N2。在将其送入灌注室之前,低氧气体MEM的pO2为40 mmHg,而正常毒气介质为160 mmHg6。 在完整的肺HPV诱导时,肺气孔pO2下降到50毫米汞下25,这种情况可以明显模仿应用低氧气体介质。我们关于HPV范围的数据与通过不同实验方法获得的结果非常匹配。山口等人。通过实时共聚焦激光扫描发光显微镜,将分离的老鼠肺应用于检查直径为20-30微米的微维斯,并配以具有图像强化器10的高灵敏度相机。他们观察到肺暴露在缺氧后直径平均减少2.7微米。我们可以计算出,当我们在系统中测量发光面积时,发光面积减少20%,直径减少约15%。
在我们的实验中,我们分别将动脉分类为前血管和癌内血管,其内径分别为40-100微米和20-40微米。在人类中,从肌肉动脉向非肌肉动脉的过渡发生在直径为70-100μm的范围内。在小鼠中,平滑的肌肉细胞的外径为20μm26。因此,无法分析直径小于 20μm 的动脉,因为根据相位对比图像无法可靠识别这些动脉。在刻度的另一端,直径超过 100 μm 的容器在 PCLS 中很难找到,通常从周围组织中剥离出来。
实际上,一些分子候选者被讨论为分子氧传感器或导致HPV的信号级联的组成部分(请参阅西尔维斯特等人的审查)。4)) 一旦有适当的淘汰小鼠,可使用视频形态学分析与野生类动物相比,癌前动脉和癌内动脉的血管活性。然而,PCLS也被用于其他问题:法鲁等人。雇用他们来描述出生后肺内皮依赖性扩张的发展,29日和PCLS准备从豚鼠每天暴露在烟雾或空气中2周,用于证明香烟烟雾对血管活性的影响,通过诱导内皮功能障碍30。
协议中的关键步骤
在我们的实验中,我们把动脉分类为前腹(内径为40-100微米)和腹内(内径为20-40微米)。特别是对于用于分析较大血管的肺部的准备,在灌注缓冲中加入硝基磷钠非常重要。这种药物可防止血管在样品制备过程中收缩,从而防止血管从周围组织撕裂,导致血管不完全蒸发生。灌注缓冲液中的硝基磷钠对于准备肺部并不那么重要,肺部应该用于分析小动脉,因为它们被牢固地固定在肺部隔膜上。
所有实验都应从测试动脉反应性的孵化开始。很少,我们获得了肺准备,其中没有船舶对承包商或扩张器的反应是检测不到的。我们不知道原因:可能是填充到肺部的糖体积太大或太低,因此将器官切入PCLS并不是最佳的。或者,可以想象,在灌输过程中,糖体冷却速度过快,导致破坏性的剪切应力。如果在单个 PCLS 中无法检测到可行的动脉,则必须丢弃该部分,并由另一条动脉替换。
关于动脉可行性的决定是基于对U46619的回应做出的。U46619 在浓度为 0.1 μM 时应用会诱发血管收缩,经过一些锻炼后,在屏幕上的图像序列中可直接看到这种收缩。由于血管活性存在一些差异,我们通过测量接触药物或仅接触药物的肺部的血管反应来调查药物对HPV的影响。
单个动脉的HPV在显微镜中通常很难检测到,平均而言,它会导致发光面积减少约20-30%。然而,动脉直径的微小变化对电流阻力有明显的输入。根据具有R=电阻和r=半径的等式”R=1/r 4″,流阻力与半径的第四个功率成反比。让我举一个例子:一条”理想动脉”,其圆形横截面直径为40μm(r=20 μm),发光面积约为1,260μm2。当发光面积减少 20% 时,我们可以计算出容器的直径减少 10.5% 至 35.8 μm(r=17.9 μm)。根据上述等式,该船的阻力将从6.25 x10-6增加到9.71 x 10-6,即约55%。如果发光面积减少30%,半径将减少约16%,但阻力将增加约100%。虽然这些计算是一种过于简单化,其中层压血流和刚性管的血管形式被假定为,它暗示了已经很小的直径变化对流量阻力的影响。
The authors have nothing to disclose.
这项研究由卓越集群心肺系统赞助。
Vibratome "Microm HM 650 V" | Microm/Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | ||
Microwave oven | Bosch, Frankfurt, Germany | HMT 702C | |
Heating cabinet | Heraeus/Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | ||
Flow-through superfusion chamber | Hugo Sachs Elektronik, March, Germany | PCLS-Bath Type: 847 SN:4017 | |
Upright inverted microscope equipped with 4X, 10X, 20X, and 40X objectives | Leica, Wetzlar, Germany | ||
CCD-camera | Stemmer Imaging, Puchheim, Germany | ||
Peristaltic pump Minipuls 3 | Gilson, Limburg-Offheim, Germany | ||
Water bath “Universal Wasserbad Isotem 205” | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | 9452450 | |
Gas tight tubes Tygon R3603-13 Øi: 3/32 in, Øa: 5/32 in, wall: 1/32 in | VWR, Darmstadt, Germany | ||
Various scissors and forceps | |||
Sewing cotton | |||
2 ml Syringe | Braun-Melsungen AG, Melsungen, Germany | ||
50 ml Syringe | Braun-Melsungen AG, Melsungen, Germany | ||
Flexible plastic pipe of an IV indwelling cannula “IntrocanR-W” (cannula 20 G x 1 ¼ in, 1.1 x 32 mm) | Braun-Melsungen AG, Melsungen, Germany | 4254112B | For instillation of the agarose into the lung |
Cannula 21 G x 4 ¾ in; 0.8 x 120 mm | Braun-Melsungen AG, Melsungen, Germany | 4665643 | For bubbling of the medium |
Cannula Nr. 17, 24 G x 1, 0.55 x 25 mm | Terumo, Eschborn, Germany | NN 2425 88DSF18 | For lung perfusion |
Normoxic gas mixture (21% O2, 5.3% CO2, 73.7% N2) | Linde, Hildesheim, Germany | ||
Hypoxic gas mixture (1% O2, 5.3% CO2, 93.7% N2) | Linde, Hildesheim, Germany | ||
HEPES | Sigma, Deisenhofen, Germany | H 4034 | |
NaCl | Roth, Karlsruhe, Germany | 3957.1 | |
KCl | Merck, Darmstadt, Germany | 1.04936.0500 | |
MgCl2•6H2O | Merck, Darmstadt, Germany | 1.05833.0250 | |
CaCl2•2H2O | Merck, Darmstadt, Germany | 1.02382.0500 | |
Glucose D-(+) | Sigma, Deisenhofen, Germany | G 7021 | |
Low melting point agarose | Bio-Rad, Munich, Germany | 161-3111 | |
Heparin-sodium | Ratiopharm, Ulm, Germany | 5120046 | |
Phenolred-free minimal essential medium (MEM) | Invitrogen, Darmstadt, Germany | 5120046 | |
70% EtOH for desinfection | Stockmeier Chemie, Dillenburg, Germany | ||
Superglue | UHU, Bühl/Baden, Germany or from a supermarket | ||
U46619 (a thromboxane analog) | Calbiochem/Merck, Darmstadt, Germany | 538944 | |
Sodium nitroprusside (Nipruss) | Schwarz Pharma, Monheim, Germany | 5332804 | |
Optimas 6.5 software | Stemmer, Puchheim, Germany | ||
SPSS 19 | AskNet, Karlsruhe, Germany |