Hypoxische pulmonale vasoconstrictie (HPV) is een belangrijk fysiologisch fenomeen waarbij bij alveolaire hypoxie longperfusie wordt afgestemd op beademing. Het belangrijkste vasculaire segment dat bijdraagt aan HPV is de intra-acinaire slagader. Hier beschrijven we ons protocol voor de analyse van HPV van muriene longvaten met diameters van 20-100 μm.
Acute alveolaire hypoxie veroorzaakt pulmonale vasoconstrictie (HPV) – ook bekend als von Euler-Liljestrand-mechanisme – die dient om longperfusie te matchen met beademing. Tot nu toe zijn de onderliggende mechanismen niet volledig begrepen. Het belangrijkste vasculaire segment dat bijdraagt aan HPV is de intra-acinaire slagader. Deze vaatsectie is verantwoordelijk voor de bloedtoevoer van een individuele acinus, die wordt gedefinieerd als het deel van de longdistaal naar een terminale bronchiol. Intra-acinaire slagaders bevinden zich meestal in dat deel van de long dat niet selectief kan worden bereikt door een aantal veelgebruikte technieken, zoals het meten van de longslagaderdruk in geïsoleerde perfuse longen of krachtopnamen van ontleed proximale longslagadersegmenten1,2. De analyse van subpleurale vaten door real-time confocale laserscan luminescentiemicroscopie is beperkt tot vaten met een diameter tot 50 μm3.
We bieden een techniek om HPV van muriene intrapulmonale slagaders te bestuderen in het bereik van 20-100 μm binnendiameters. Het is gebaseerd op de videomorfometrische analyse van doorsneden slagaders in nauwkeurig gesneden longschijfjes (PCLS). Deze methode maakt de kwantitatieve meting mogelijk van vasoreactiviteit van kleine intra-acinaire slagaders met een inwendige diameter tussen 20-40 μm die zich bevinden bij gussets van alveolaire septa naast alveolaire kanalen en van grotere pre-acinaire slagaders met binnendiameters tussen 40-100 μm die grenzen aan bronchiën en bronchiolen. In tegenstelling tot real-time beeldvorming van subpleurale vaten bij verdoofde en geventileerde muizen, vindt videomorfometrische analyse van PCLS plaats onder omstandigheden die vrij zijn van schuifspanning. In ons experimentele model vertonen beide arteriële segmenten een monofasische HPV bij blootstelling aan medium vergast met 1% O2 en de respons vervaagt na 30-40 minuten bij hypoxie.
In de meeste systemische vasculaire bedden induceert hypoxie vasodilatatie, in vergelijking met de vasoconstrictie veroorzaakt door hypoxie in de long vasculatuur. Deze longspecifieke reactie op verlaagde zuurstofspanning wordt hypoxische pulmonale vasoconstrictie (HPV) genoemd, wordt binnen enkele seconden ingeschakeld en keert snel terug na terugschakelen naar normoxische beademing. Hoewel HPV al meer dan 60 jaar bekend is, zijn de cellulaire zuurstofsensor(en) en de signaalcascade(n) die resulteert in vasoconstrictie nog steeds onderwerp van discussie. Er is een relatief brede consensus dat hypoxie-opgeroepen redox- en ROS-veranderingen essentieel zijn voor HPV en de ontwikkeling van pulmonale hypertensie (beoordeeld in Sylvester et al. 4 en Schumacker e.a. 5). Onze eigen gegevens ondersteunen een centrale rol van complex II van de mitochondriale ademhalingsketen in HPV6,7. Onlangs, Wang et al. presenteerde een volledig nieuw concept voor zuurstofdetectie en HPV: Op basis van hun gegevens stellen ze voor dat alveolaire hypoxie wordt waargenomen door de aangrenzende haarvaten die membraandepolarisatie van de endotheelcellen veroorzaken. De respons wordt gepropageerd via connexion 40 gap junctions van de endotheelcellen wat leidt tot vernauwing van gladde spiercellen van upstream arterioles8.
De slagaders van de long lopen langs de luchtwegen, vertakken zich ermee, nemen voortdurend af in diameter en leveren ten slotte bloed aan het capillaire systeem in de alveolaire wanden. Deze arteriële circulatie bestaat uit anatomisch en functioneel verschillende segmenten. De proximale buisslagaders, gekenmerkt door een overvloed aan elastische vezels in de wanden, worden gevolgd door volledig gespierde intrapulmonale slagaders die de pulmonale vasculaire weerstand grotendeels beheersen. Stap voor stap gaan deze slagaders over in segmenten waar de spierlaag onvolledig wordt, en ten slotte zijn de vaten vrij van gladde spier actine-immunoreactieve cellen. De intra-acinaire slagader die een individuele longacuinus met bloed voedt, vertegenwoordigt een gedeeltelijk gespierd segment6. Evenzo vertegenwoordigt het longslagadersysteem geen uniforme structuur met betrekking tot de hypoxische respons, maar vertoont het een duidelijke regionale diversiteit9,10. Bijvoorbeeld, in proximale longslagaders geïsoleerd van rattenlongen induceert hypoxie een bifasische respons, met een aanvankelijke snelle samentrekking van korte duur die – na onvolledige ontspanning – wordt gevolgd door een tweede langzame maar aanhoudende contractie11. In weerstandsslagaders geïsoleerd van ratlongparenchym als vierde- en vijfde-deling van longslagaders (uitwendige diameter <300 μm), veroorzaakt hypoxie monofasische vernauwing9. Reeds in 1971 concludeerden Glazier en Murray uit metingen van veranderingen in de capillaire rode bloedcelconcentratie in longen van honden geventileerd met hypoxische gasmengsels dat de door hypoxie veroorzaakte toename van de vasculaire weerstand voornamelijk vóór de haarvaten voorkwam12. Tegenwoordig is intravitale microscopie van intacte longen van verdoofde en mechanisch geventileerde muizen een krachtig hulpmiddel voor de analyse van de longmicrovasculatuur13,14. Excisie van een cirkelvormig venster in de thoracale wand geeft microscopische toegang tot het oppervlak van de long en maakt de analyse van subpleurale longvaten met een diameter tot 50 μm mogelijk. Door deze techniek te combineren met de infusie van FITC-dextran, Tabuchi et al. aangetoond dat alleen middelgrote arteriolen met diameters van 30-50 μm een duidelijke respons vertonen op hypoxie die gedurende een periode van 60 minuten met een lichte verzwakking na 30 minuten aanhield. Kleine arteriolen met diameters van 20-30 μm vertoonden daarentegen slechts een kleine respons op hypoxie3. Deze techniek maakt het echter niet mogelijk om slagaders met een diameter groter dan 50 μm te analyseren, omdat deze vaten zich te diep in het longweefsel bevinden.
Om de kloof in de analyse van grote en zeer kleine longslagaders (zoals de subpleurale vaten) van muriene longen te overbruggen, hebben we een methode aangenomen die werd beschreven door Martin et al. voor de analyse van de reactiviteit van de luchtwegen15. Gebaseerd op een agarose gel instilling techniek, het vergemakkelijkt de bereiding van precisie gesneden longschijfjes (PCLS) van dit relatief zachte en elastische orgaan. Binnen de PCLS vasoreactiviteit van doorsneden slagaders met een inwendige diameter tussen 20-100 μm kan direct worden waargenomen door videomicroscopie. Toepassing van geneesmiddelen tijdens de hypoxische incubatie van de PCLS maakt de analyse van hun effecten op HPV mogelijk. Het is van bijzonder belang dat deze techniek ook kan worden toegepast op genetisch gemanipuleerde muizen. Op basis van hun locatie in de long classificeren we de slagaders als pre- en intra-acinaire vaten, met binnendiameters van respectievelijk 20-40 μm en 40-100 μm. Onder een functioneel zicht voorziet de intra-acinaire slagader een individuele longacuinus van bloed en de pre-acinaire slagader zijn de voorgaande vaatsecties. Het opnemen van foto’s op een digitale camera maakt de daaropvolgende kwantificering van de vasoreactie mogelijk. Een voor de hand liggend kenmerk van dit PCLS-model is het gebrek aan schuifspanning dat op het endotheel inwerkt. In doordrenkte vaten leidt acute HPV daarentegen tot een toename van schuifspanning, waardoor secundaire mechanismen zoals NO release16worden geïnduceerd. Bovendien maakt het gebruik van PCLS metingen van HPV mogelijk zonder extrapulmonale neurale of hormonale invloeden. In tegenstelling tot celkweeksystemen, bijvoorbeeld bereid uit canine pulmonale gladde spiercellen17, is de histologische architectuur van de vaatwand bijna volledig bewaard gebleven.
Samengevat biedt dit protocol een nuttige methode voor de analyse van potentiële moleculaire zuurstofsensoren en/of cellulaire routes die verantwoordelijk zijn voor HPV van intrapulmonale slagaders met inwendige diameters tussen 20-100 μm onder omstandigheden die vrij zijn van schuifspanning.
De geïsoleerde geventileerde en doordrenkte muislong is een uitstekend model voor de analyse van de fysiologische respons van het long vasculaire systeem op veranderingen in de zuurstoftoevoer en maakt onder andere de continue meting van de longslagaderdruk1mogelijk. Dit model staat echter niet toe dat die vasculaire segmenten worden geïdentificeerd en geanalyseerd die de sterkste respons op hypoxie laten zien. Dit is het voordeel van onze videomorfometrische analyse van PCLS die de meting van HPV van individuele slagaders met binnendiameters van 20-100 μm vergemakkelijkt. PCLS vertegenwoordigen een aantrekkelijk in vitro model omdat ze sterk lijken op het orgaan waaruit ze zijn voorbereid. In tegenstelling tot celkweeksystemen zijn alle celtypen aanwezig in hun oorspronkelijke weefselmatrixconfiguratie. Bovendien is één long voldoende voor de bereiding van veel PCLS, zodat ten minste gedeeltelijk experimenten kunnen worden gestandaardiseerd door het gebruik van secties van dezelfde muis. Volgens het 3R-concept (reductie, verfijning en vervanging van proefdieren in de biowetenschappen) van Russell en Burch23 pleit dit feit ook voor het gebruik van PCLS.
Men moet echter in gedachten houden dat het weefsel wordt beschadigd door snijden met een vibratoom en longitudinale signalering, bijvoorbeeld via de endotheelcellen zoals gepostuleerd door Kübler et al. 14 is niet meer mogelijk.
Aanvankelijk werden PCLS voornamelijk toegepast voor biochemische, farmacologische en toxicologische studies, maar in de tussentijd worden ze ook gebruikt voor het meten van bronchiale contractiliteit, mucociliaire functie en vasculaire reacties (voor beoordelingen zie Sanderson20 en Davies21). Held et al. een studie hebben uitgevoerd waarin zij de modellen van geïsoleerde doordrenkte en geventileerde muislong en van PCLS24vergeleken . Ze ontdekten door analyse van de reacties van luchtwegen en longvaten op een verscheidenheid aan endogene mediatoren dat belangrijke kenmerken van de hele long in PCLS werden gehandhaafd.
Bij PCLS worden hypoxische aandoeningen niet vastgesteld via de luchtwegen zoals in de intacte long, maar door incubatie van de longsectie in hypoxisch vergast medium. We hebben de zuurstof partiële druk (pO2)van medium voorvergast met respectievelijk 1% O2,5,3% CO2,93,7% N2 en met 21% O2,5,3% CO2,73,7% N2geanalyseerd met behulp van een bloedgasanalysator. Onmiddellijk voordat het in de perfusiekamer werd gevoerd, was pO2 van de hypoxische vergaste MEM 40 mmHg en die van het normoxische vergaste medium 160 mmHg6. In de intacte long wordt HPV geïnduceerd wanneer alveolaire pO2 daalt tot onder 50 mmHg25, een situatie die duidelijk kan worden nagebootst door toepassing van hypoxisch vergast medium. Onze gegevens over de omvang van HPV komen goed overeen met resultaten verkregen met een andere experimentele aanpak. Yamaguchi e.a. geïsoleerde rattenlongen hebben toegepast om microvessels met een diameter van 20-30 μm te onderzoeken door real-time confocale laserscan-luminescentiemicroscopie gekoppeld aan een zeer gevoelige camera met een beeldversterker10. Ze zagen een gemiddelde diametervermindering van 2,7 μm na blootstelling van de longen aan hypoxie. Men kan berekenen dat een vermindering van 20% van het luminale gebied zoals we het in ons systeem meten overeenkomt met ongeveer 15% afname in diameter.
In onze experimenten hebben we de slagaders geclassificeerd als respectievelijk pre- en intra-acinaire vaten met binnendiameters van 40-100 μm en 20-40 μm. Bij mensen vindt de overgang van spier- naar niet-amusculaire slagaders plaats in het diameterbereik van 70-100 μm. Bij muizen zijn gladde spiercellen aanwezig tot een uitwendige diameter van 20 μm26. Om deze reden is het niet mogelijk om slagaders met diameters onder 20 μm te analyseren, omdat ze niet betrouwbaar kunnen worden geïdentificeerd op basis van het fasecontrastbeeld. Aan de andere kant van de schaal zijn vaten met diameters van meer dan 100 μm nauwelijks te vinden in PCLS en vaak ontdaan van het omliggende weefsel.
Eigenlijk worden een aantal moleculaire kandidaten besproken als moleculaire zuurstofsensor(en) of als onderdeel van de signaalcascade resulterend in HPV (voor een overzicht zie Sylvester et al. 4). Zodra geschikte knock-out muizen beschikbaar zijn, kan videomorfometrie worden gebruikt voor de analyse van vasoreactiviteit van pre- en intra-acinaire slagaders in vergelijking met wilde dieren. PCLS zijn echter ook gebruikt voor andere kwesties: Faro et al. gebruikt om de ontwikkeling van het endotheelafhankelijke verwijding in de long na de geboorte te karakteriseren29 en PCLS bereid door cavia’s die dagelijks gedurende 2 weken aan rook of lucht werden blootgesteld, werden gebruikt om de impact van sigarettenrook op vasoreactiviteit aan te tonen via inductie van endotheeldisfunctie30.
Kritieke stappen binnen het protocol
In onze experimenten classificeerden we de slagaders als pre-acinair (binnendiameters van 40-100 μm) en intra-acinair (binnendiameters van 20-40 μm). Vooral voor de voorbereiding van longsecties die moeten worden gebruikt voor de analyse van grotere vaten is het belangrijk om natrium nitroprusside toe te voegen aan de perfusiebuffer. Dit medicijn voorkomt de samentrekking van de vaten tijdens het monsterpreparaat en daardoor hun afzet van het omliggende weefsel, wat leidt tot onvolledige vasodilatatie. Natrium nitroprusside in de perfusiebuffer is niet zo belangrijk voor de voorbereiding van de longsectie die moet worden gebruikt voor analyse van kleine slagaders omdat ze sterk verankerd zijn aan de alveolaire septa.
Alle experimenten moeten worden gestart met incubaties waarbij de reactiviteit van de slagaders wordt getest. Zelden kregen we longpreparaten waarbij geen reactie van vaten op aannemers of dilatatoren detecteerbaar was. We weten de reden hiervoor niet: Het kan zijn dat het volume van de agarose gevuld in de longen te groot of te laag was, zodat het snijden van het orgaan in PCLS niet optimaal was. Als alternatief is het denkbaar dat de agarose te snel afkoelde tijdens de instillatieprocedure, wat resulteerde in schadelijke schuifspanning. In het geval dat in een individuele PCLS geen levensvatbare slagader kan worden gedetecteerd, moet de sectie worden weggegooid en vervangen door een andere.
De beslissing over de levensvatbaarheid van een slagader werd genomen op basis van de reactie op U46619. Toepassing van U46619 bij een concentratie van 0,1 μM induceert een vasoconstrictie die – na enige oefening – direct zichtbaar is in de beeldsequentie op het scherm. Omdat er enkele afwijkingen zijn in de vasoreactiviteit, onderzoeken we de impact van een medicijn op HPV door de vasorespons te meten in longsecties die op hun beurt aan het medicijn of aan het medium alleen zijn blootgesteld.
HPV van een individuele slagader is vaak nauwelijks detecteerbaar in de microscoop, en gemiddeld resulteert dit in een vermindering van het luminale gebied van ongeveer 20-30%. Kleine veranderingen in de diameter van een slagader hebben echter een duidelijke input voor de stromingsweerstand. Volgens de vergelijking “R = 1/r4” met R=weerstand en r=radius is de stroomweerstand omgekeerd evenredig met de vierde macht van de straal. Laat ik een voorbeeld geven: Een “ideale slagader” met een cirkelvormige doorsnede met een diameter van 40 μm (r=20 μm) heeft een lichtgevend gebied van ongeveer 1.260 μm2. Wanneer het luminale gebied met 20% wordt verminderd, kunnen we berekenen dat de diameter van het vat met 10,5% wordt verminderd tot 35,8 μm (r = 17,9 μm). Volgens de bovenstaande vergelijking zou de stromingsweerstand van dit vat toenemen van 6,25 x 10-6 tot 9,71 x 10-6, dat is met ongeveer 55%. In het geval van een vermindering van het luminale gebied met 30% zou de straal met ongeveer 16% afnemen, maar de stroomweerstand zou met ongeveer 100% toenemen. Hoewel deze berekeningen een oversimplificatie zijn waarbij een laminaire bloedstroom en een bloedvatvorm van een stijve pijp worden verondersteld, is het suggestief voor de impact van reeds kleine veranderingen van de diameter op de stromingsweerstand.
The authors have nothing to disclose.
Dit onderzoek wordt gesponsord door het Excellence Cluster Cardio-Pulmonary System.
Vibratome "Microm HM 650 V" | Microm/Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | ||
Microwave oven | Bosch, Frankfurt, Germany | HMT 702C | |
Heating cabinet | Heraeus/Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | ||
Flow-through superfusion chamber | Hugo Sachs Elektronik, March, Germany | PCLS-Bath Type: 847 SN:4017 | |
Upright inverted microscope equipped with 4X, 10X, 20X, and 40X objectives | Leica, Wetzlar, Germany | ||
CCD-camera | Stemmer Imaging, Puchheim, Germany | ||
Peristaltic pump Minipuls 3 | Gilson, Limburg-Offheim, Germany | ||
Water bath “Universal Wasserbad Isotem 205” | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | 9452450 | |
Gas tight tubes Tygon R3603-13 Øi: 3/32 in, Øa: 5/32 in, wall: 1/32 in | VWR, Darmstadt, Germany | ||
Various scissors and forceps | |||
Sewing cotton | |||
2 ml Syringe | Braun-Melsungen AG, Melsungen, Germany | ||
50 ml Syringe | Braun-Melsungen AG, Melsungen, Germany | ||
Flexible plastic pipe of an IV indwelling cannula “IntrocanR-W” (cannula 20 G x 1 ¼ in, 1.1 x 32 mm) | Braun-Melsungen AG, Melsungen, Germany | 4254112B | For instillation of the agarose into the lung |
Cannula 21 G x 4 ¾ in; 0.8 x 120 mm | Braun-Melsungen AG, Melsungen, Germany | 4665643 | For bubbling of the medium |
Cannula Nr. 17, 24 G x 1, 0.55 x 25 mm | Terumo, Eschborn, Germany | NN 2425 88DSF18 | For lung perfusion |
Normoxic gas mixture (21% O2, 5.3% CO2, 73.7% N2) | Linde, Hildesheim, Germany | ||
Hypoxic gas mixture (1% O2, 5.3% CO2, 93.7% N2) | Linde, Hildesheim, Germany | ||
HEPES | Sigma, Deisenhofen, Germany | H 4034 | |
NaCl | Roth, Karlsruhe, Germany | 3957.1 | |
KCl | Merck, Darmstadt, Germany | 1.04936.0500 | |
MgCl2•6H2O | Merck, Darmstadt, Germany | 1.05833.0250 | |
CaCl2•2H2O | Merck, Darmstadt, Germany | 1.02382.0500 | |
Glucose D-(+) | Sigma, Deisenhofen, Germany | G 7021 | |
Low melting point agarose | Bio-Rad, Munich, Germany | 161-3111 | |
Heparin-sodium | Ratiopharm, Ulm, Germany | 5120046 | |
Phenolred-free minimal essential medium (MEM) | Invitrogen, Darmstadt, Germany | 5120046 | |
70% EtOH for desinfection | Stockmeier Chemie, Dillenburg, Germany | ||
Superglue | UHU, Bühl/Baden, Germany or from a supermarket | ||
U46619 (a thromboxane analog) | Calbiochem/Merck, Darmstadt, Germany | 538944 | |
Sodium nitroprusside (Nipruss) | Schwarz Pharma, Monheim, Germany | 5332804 | |
Optimas 6.5 software | Stemmer, Puchheim, Germany | ||
SPSS 19 | AskNet, Karlsruhe, Germany |