Hypoxisk lungevakostrition (HPV) er et vigtigt fysiologisk fænomen, hvorved alveolar hypoxi lunge perfusion matches til ventilation. Det største vaskulære segment, der bidrager til HPV, er intra-acinar arterien. Her beskriver vi vores protokol for analyse af HPV af murinpulmonære fartøjer med en diameter på 20-100 μm.
Akut alveolar hypoxi forårsager lungevakostrition (HPV) – også kendt som von Euler-Liljestrand mekanisme – som tjener til at matche lunge perfusion til ventilation. Indtil nu er de underliggende mekanismer ikke fuldt ud forstået. Det største vaskulære segment, der bidrager til HPV, er intra-acinar arterien. Denne karsektion er ansvarlig for blodforsyningen af en individuel acinus, der defineres som den del af lungerne, der er distal til en terminalbronchiole. Intra-acinar arterier er for det meste placeret i den del af lungen, der ikke kan opnås selektivt ved en række almindeligt anvendte teknikker såsom måling af lungepulsåren tryk i isolerede perfunderes lunger eller kraft optagelser fra dissekeret proksimale lungepulsåren segmenter1,2. Analysen af subpleurale beholdere ved realtids confocal laserscanning luminescensmikroskopi er begrænset til beholdere med en diameter på op til 50 μm i diameter3.
Vi leverer en teknik til at studere HPV af murin intra-lungearterier i intervallet 20-100 μm indre diametre. Den er baseret på den videomorfometriske analyse af tværsnitsarterier i præcisionsskårne lungeskiver (PCLS). Denne metode gør det muligt at måle vasoreaktiviteten i små arterier inden for acinar med indvendig diameter på mellem 20 og 40 μm, som er placeret ved kiler af alveolar septa ved siden af alveolarkanaler og af større præ-acinararterier med indvendige diametre mellem 40-100 μm, der løber ved siden af bronchi og bronchioles. I modsætning til realtidsbilleddannelse af subpleurale beholdere i bedøvede og ventilerede mus forekommer videomorfometrisk analyse af PCLS under forhold, der er fri for forskydningsstress. I vores eksperimentelle model udviser begge arterielle segmenter en monofasisk HPV, når de udsættes for medium gasset med 1% O2, og reaktionen falmer efter 30-40 minutter ved hypoxi.
I de fleste systemiske vaskulære senge hypoxi inducerer vasodilatation, i forhold til vasoconstriction forårsaget af hypoxi i lungevakulaturen. Denne lunge-specifikke reaktion på nedsat iltspænding kaldes hypoxisk lungevakostrition (HPV), debut inden for få sekunder og vender hurtigt efter switchback til normoxisk ventilation. Selvom HPV er kendt i mere end 60 år, er den eller de cellulære iltsensorer og den eller de signalkaskade(er), der resulterer i vasoconstriction, stadig under debat. Der er relativ bred enighed om, at hypoxi-fremkaldte redox- og ROS-ændringer er afgørende for HPV og udviklingen af pulmonal hypertension (gennemgået i Sylvester et al. 4 og Schumacker et al. 5). Vores egne data understøtter en central rolle i komplekse II i mitokondrie åndedrætskæden i HPV6,7. For nylig Wang et al. præsenteret et helt nyt koncept for iltføling og HPV: Baseret på deres data foreslår de, at alveolar hypoxi fornemmes af de tilstødende kapillærer, der forårsager membrandepolarisering af endotelcellerne. Reaktionen formeres via connexion 40 hul vejkryds af endotelceller, der fører til indsnævring af glatte muskelceller i opstrøms arterioler8.
Arterierne i lungerne løber langs luftvejene, gren med dem, løbende fald i diameter, og endelig levere blod til kapillærsystemet placeret i alveolar vægge. Denne arterielle cirkulation er sammensat af anatomisk og funktionelt forskellige segmenter. De proksimale rørarterier, der er karakteriseret ved en overflod af elastiske fibre i væggene, efterfølges af fuldt muskuløse intrapulmonale arterier, som i vid udstrækning styrer lungevaskulær modstand. Trin-for-trin, disse arterier transit i segmenter, hvor muskellaget bliver ufuldstændig, og endelig fartøjerne er fri for glatte muskel actin-immunoreaktive celler. Den intra-acinar arterie fodring en individuel lunge acinus med blod repræsenterer en delvis muskuløs segment6. Ligeledes repræsenterer lungepulsåresystemet ikke en ensartet struktur med hensyn til den hypoksiske reaktion, men udviser markant regional mangfoldighed9,10. For eksempel fremkalder hypoxiia i proksimale lungearterier isoleret fra rotte lunger en bifasisk reaktion, der viser en indledende hurtig sammentrækning af kort varighed, som – efter ufuldstændig afslapning – efterfølges af en anden langsom, men vedvarende sammentrækning11. I modstandsarterier isoleret fra rotte lunge parenchyma som fjerde- og femte division af lungearterier (ekstern diameter <300 μm), hypoxi forårsager monofasisk indsnævring9. Allerede i 1971 konkluderede Glazier og Murray fra målinger af ændringer i kapillær røde blodlegemer koncentration i lungerne hos hunde ventileret med hypoxic gas blandinger, at hypoxi-induceret stigning i vaskulær resistens hovedsagelig fandt sted opstrøms for kapillærerne12. I dag repræsenterer intravital mikroskopi af intakte lunger af bedøvede og mekanisk ventilerede mus et kraftfuldt værktøj til analyse af lungemikrovasculaturen13,14. Udskæring af et cirkulært vindue i brystvæggen giver mikroskopisk adgang til lungernes overflade og gør det muligt at analysere subpleurale lungefartøjer med en diameter på op til 50 μm. Ved at kombinere denne teknik med infusionen af FITC-dextran, Tabuchi et al. påviste, at kun mellemstore arterioler med en diameter på 30-50 μm udviser en markant reaktion på hypoxi, som opretholdt over en periode på 60 minutter med en mindre dæmpning efter 30 min. I modsætning hertil viste små arterioler med diametre på 20-30 μm kun en mindre reaktion på hypoxi3. Denne teknik tillader dog ikke analyse af arterier med diameter, der er større end 50 μm, da disse fartøjer er placeret for dybt i lungevævet.
For at bygge bro over kløften i analysen af store og meget små lungearterier (såsom subpleural fartøjer) af murin lunger, vi vedtog en metode, der blev beskrevet af Martin et al. til analyse af luftvejenes reaktivitet15. Baseret på en agarose gel indgyde teknik, det letter forberedelsen af præcision skåret lunge skiver (PCLS) fra denne relativt bløde og elastiske organ. Inden for PCLS vasoreaktivitet af tværsnitsarterier med indvendig diameter mellem 20-100 μm kan observeres direkte ved videomikroskopi. Anvendelse af lægemidler under den hypoksiske inkubation af PCLS gør det muligt at analysere deres virkninger på HPV. Det er særlig vigtigt, at denne teknik også kan anvendes på gensplejset mus. Baseret på deres placering i lungerne klassificerer vi arterierne som præ- og intra-acinarbeholdere med indvendige diametre på henholdsvis 20-40 μm og 40-100 μm. Under et funktionelt synspunkt intra-acinar arterie leverer en individuel lunge acinus med blod og præ-acinar arterie er den foregående fartøj sektioner. Optagelse af billeder på et digitalt kamera giver mulighed for efterfølgende kvantificering af vasoreaktion. En indlysende egenskab ved denne PCLS-model er manglen på shear-stress, der virker på endothelium. I modsætning hertil fører akut HPV i perfunderede beholdere til en stigning i forskydningsstress, hvilket fremkalder sekundære mekanismer som NO release16. Derudover tillader brugen af PCLS målinger af HPV uden ekstrapulmoniske neurale eller hormonelle påvirkninger. I modsætning til cellekultursystemer, for eksempel fremstillet af hundepulmonal arterielle glatte muskelceller17, er karvæggens histologiske arkitektur næsten helt bevaret.
Sammenfattende giver denne protokol en nyttig metode til analyse af potentielle molekylære iltsensorer og/eller cellulære veje, der er ansvarlige for HPV i intrapulmonal arterier med indvendige diametre på mellem 20-100 μm under forhold, der er fri for forskydningsstress.
Den isolerede ventilerede og perfunderede muse lunger er en glimrende model til analyse af lungepulsårens fysiologiske respons på ændringer i ilttilførslen og tillader blandt andet kontinuerlig måling af lungepulsårens tryk1. Denne model tillader dog ikke identifikation og analyse af de vaskulære segmenter, der viser den stærkeste reaktion på hypoxi. Dette er fordelen ved vores videomorfometriske analyse af PCLS, som letter målingen af HPV af individuelle arterier med indvendige diametre på 20-100 μm. PCLS repræsenterer en attraktiv in vitro-model, da de ligner det organ, hvorfra de fremstilles. I modsætning til cellekultursystemer er alle celletyper til stede i deres oprindelige vævsmatrixkonfiguration. Desuden er en lunge tilstrækkelig til fremstilling af mange PCLS, således at i det mindste delvist eksperimenter kan standardiseres ved brug af sektioner fra samme mus. Ifølge 3R-konceptet (reduktion, raffinement og udskiftning af forsøgsdyr i biovidenskab) af Russell og Burch23 argumenterer dette også for brugen af PCLS.
Man skal dog huske på, at vævet beskadiges ved at skære med en vibratome og langsgående signalering for eksempel via endotelcellerne som postuleret af Kübler et al. 14 er ikke længere muligt.
I begyndelsen blev PCLS hovedsagelig anvendt til biokemiske, farmakologiske og toksikologiske undersøgelser, men i mellemtiden anvendes de også til måling af bronkial kontraktilitet, mucociliary funktion og vaskulære reaktioner (for anmeldelser se Sanderson20 og Davies21). Afholdt et al. har udført en undersøgelse, hvor de sammenlignede modellerne af isoleret perfunderet og ventileret muse lunger og PCLS24. De fandt ved analyse af luftvejenes og lungefartøjernes reaktioner på en række endogene mæglere, at vigtige egenskaber ved hele lungerne blev opretholdt i PCLS.
I PCLS er hypoksiske tilstande ikke etableret via luftvejene som i den intakte lunge, men ved inkubation af lungesektionen i hypoxisk-gasset medium. Vi har analyseret ilt delvis tryk (pO2)af medium forgasset med 1% O2, 5,3% CO2, 93,7% N2 og med 21% O2, 5,3% CO2, 73,7% N2, henholdsvis ved hjælp af en blodgas analysator. Umiddelbart før den blev tilsat perfusionskammeret, var pO2 i den hypoxiske gassede MEM 40 mmHg og den normoxiske gassede medium 160 mmHg6. I den intakte lunge HPV induceres, når alveolar pO2 falder til under 50 mmHg25, en situation, der naturligvis kan efterlignes ved anvendelse af hypoxisk-gasset medium. Vores data om omfanget af HPV matcher godt til resultater opnået med en anden eksperimentel tilgang. Yamaguchi et al. har anvendt isolerede rotte lunger til at undersøge mikrovesseler med en diameter på 20-30 μm ved real-time confocal laserscanning luminescens mikroskopi koblet til en høj følsomhed kamera med et billede forstærker10. De observerede en gennemsnitlig reduktion i diameter på 2,7 μm efter eksponering af lungerne for hypoxi. Man kan beregne, at en 20% reduktion af det luminale område, som vi måler det i vores system svarer til omkring 15% fald i diameter.
I vores eksperimenter har vi klassificeret arterierne som henholdsvis præ- og intra-acinarbeholdere med indvendige diametre på henholdsvis 40-100 μm og 20-40 μm. Hos mennesker sker overgangen fra muskuløse til ikkemuskulære arterier i diameterområdet 70-100 μm. Hos mus er glatte muskelceller til stede ned til en ekstern diameter på 20 μm26. Af denne grund er det ikke muligt at analysere arterier med diametre under 20 μm, da de ikke kan pålidelige identificeres baseret på fasekontrastbilledet. I den anden ende af skalaen er fartøjer med en diameter på over 100 μm næppe at finde i PCLS og almindeligvis fjernet fra det omgivende væv.
Faktisk diskuteres en række molekylære kandidater som molekylær iltsensor (r) eller som en del af signalkaskaden, hvilket resulterer i HPV (for en gennemgang se Sylvester et al. 4). Når passende knockout mus er tilgængelige videomorfometrisk kan bruges til analyse af vasoreaktivitet af præ-og intra-acinar arterier i forhold til vilde type dyr. Pcls er dog også blevet brugt til andre spørgsmål: Faro et al. ansat dem til at karakterisere udviklingen af endotelafhængig dilation i lungerne efter fødslen29 og PCLS fremstillet af marsvin, der dagligt blev udsat for røg eller luft i 2 uger, blev brugt til at påvise cigaretrøgs indvirkning på vasoreaktivitet via induktion af endotel dysfunktion30.
Kritiske trin i protokollen
I vores eksperimenter klassificerede vi arterierne som præ-acinar (indvendige diametre på 40-100 μm) og intra-acinar (indvendige diametre på 20-40 μm). Især til fremstilling af lungesektioner, der skal anvendes til analyse af større beholdere, er det vigtigt at tilføje natriumnitroprusside til perfusionsbufferen. Dette lægemiddel forhindrer sammentrækning af karrene under prøveforberedelsen og derved deres rip off fra det omgivende væv, der fører til ufuldstændig vasodilation. Natriumnitroprusside i perfusionsbufferen er ikke så vigtig for forberedelsen af lungesektionen, som bør anvendes til analyse af små arterier, fordi de er stærkt forankret til alveolar septa.
Alle forsøg skal startes med inkubationer, hvor arteriernes reaktivitet testes. Sjældent opnåede vi lungepræparater, hvor skibenes reaktion på entreprenører eller dilatatorer ikke kunne påvises. Vi kender ikke årsagen til dette: Kan være, at mængden af agarose fyldt i lungerne var for stor eller for lav, så skæring af organet i PCLS ikke var optimal. Alternativt er det tænkeligt, at agarose kølede ned for hurtigt under indgydelsesproceduren, hvilket resulterede i skadelig forskydningsstress. Hvis der i en individuel PCLS ikke kan påvises nogen levedygtig arterie, skal sektionen kasseres og erstattes af en anden.
Beslutningen om levedygtigheden af en arterie blev truffet på grundlag af reaktionen på U46619. Anvendelse af U46619 i en koncentration på 0,1 μM fremkalder en vasoconstriction, som – efter en vis øvelse – er synlig direkte i billedsekvensen på skærmen. Da der er nogle afvigelser i vasoreaktiviteten, undersøger vi virkningen af et lægemiddel på HPV ved at måle vasoresponset i lungesektioner, der udsættes for stoffet eller til mediet alene igen.
HPV af en individuel arterie er ofte næppe påvises i mikroskopet, og i gennemsnit resulterer det i en reduktion af det luminale område på omkring 20-30%. Men små ændringer i diameteren af en arterie har en særskilt input på flow modstand. Ifølge ligningen “R = 1/r4″med R=modstand og r=radius er strømningsmodstanden omvendt proportional med radiusens fjerde effekt. Lad mig give et eksempel: En “ideel arterie”, der udviser et cirkulært tværsnit med en diameter på 40 μm (r = 20 μm) har et luminalt område på ca. 1.260 μm2. Når det luminale område reduceres med 20%, kan vi beregne, at beholderens diameter reduceres med 10,5% til 35,8 μm (r = 17,9 μm). Ifølge ligningen ovenfor vil dette fartøjs strømningsmodstand stige fra 6,25 x 10-6 til 9,71 x 10-6, der er med ca. 55%. I tilfælde af en reduktion af det luminale område med 30% ville radius falde med ca. 16%, men strømningsmodstanden ville stige med ca. 100%. Selv om disse beregninger er en oversimplificering, hvor en laminar blodgennemstrømning og en kar form af et stift rør antages det tyder på virkningen af allerede mindre ændringer i diameteren på flow modstand.
The authors have nothing to disclose.
Denne forskning er sponsoreret af Excellence Cluster Cardio-Pulmonary System.
Vibratome "Microm HM 650 V" | Microm/Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | ||
Microwave oven | Bosch, Frankfurt, Germany | HMT 702C | |
Heating cabinet | Heraeus/Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | ||
Flow-through superfusion chamber | Hugo Sachs Elektronik, March, Germany | PCLS-Bath Type: 847 SN:4017 | |
Upright inverted microscope equipped with 4X, 10X, 20X, and 40X objectives | Leica, Wetzlar, Germany | ||
CCD-camera | Stemmer Imaging, Puchheim, Germany | ||
Peristaltic pump Minipuls 3 | Gilson, Limburg-Offheim, Germany | ||
Water bath “Universal Wasserbad Isotem 205” | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | 9452450 | |
Gas tight tubes Tygon R3603-13 Øi: 3/32 in, Øa: 5/32 in, wall: 1/32 in | VWR, Darmstadt, Germany | ||
Various scissors and forceps | |||
Sewing cotton | |||
2 ml Syringe | Braun-Melsungen AG, Melsungen, Germany | ||
50 ml Syringe | Braun-Melsungen AG, Melsungen, Germany | ||
Flexible plastic pipe of an IV indwelling cannula “IntrocanR-W” (cannula 20 G x 1 ¼ in, 1.1 x 32 mm) | Braun-Melsungen AG, Melsungen, Germany | 4254112B | For instillation of the agarose into the lung |
Cannula 21 G x 4 ¾ in; 0.8 x 120 mm | Braun-Melsungen AG, Melsungen, Germany | 4665643 | For bubbling of the medium |
Cannula Nr. 17, 24 G x 1, 0.55 x 25 mm | Terumo, Eschborn, Germany | NN 2425 88DSF18 | For lung perfusion |
Normoxic gas mixture (21% O2, 5.3% CO2, 73.7% N2) | Linde, Hildesheim, Germany | ||
Hypoxic gas mixture (1% O2, 5.3% CO2, 93.7% N2) | Linde, Hildesheim, Germany | ||
HEPES | Sigma, Deisenhofen, Germany | H 4034 | |
NaCl | Roth, Karlsruhe, Germany | 3957.1 | |
KCl | Merck, Darmstadt, Germany | 1.04936.0500 | |
MgCl2•6H2O | Merck, Darmstadt, Germany | 1.05833.0250 | |
CaCl2•2H2O | Merck, Darmstadt, Germany | 1.02382.0500 | |
Glucose D-(+) | Sigma, Deisenhofen, Germany | G 7021 | |
Low melting point agarose | Bio-Rad, Munich, Germany | 161-3111 | |
Heparin-sodium | Ratiopharm, Ulm, Germany | 5120046 | |
Phenolred-free minimal essential medium (MEM) | Invitrogen, Darmstadt, Germany | 5120046 | |
70% EtOH for desinfection | Stockmeier Chemie, Dillenburg, Germany | ||
Superglue | UHU, Bühl/Baden, Germany or from a supermarket | ||
U46619 (a thromboxane analog) | Calbiochem/Merck, Darmstadt, Germany | 538944 | |
Sodium nitroprusside (Nipruss) | Schwarz Pharma, Monheim, Germany | 5332804 | |
Optimas 6.5 software | Stemmer, Puchheim, Germany | ||
SPSS 19 | AskNet, Karlsruhe, Germany |