Hypoksisk lungevaokonstriksjon (HPV) er et viktig fysiologisk fenomen der ved alveolar hypoksi lungeperfusjon er tilpasset ventilasjon. Det viktigste vaskulære segmentet som bidrar til HPV er den intra-acinare arterien. Her beskriver vi vår protokoll for analyse av HPV av murin lungefartøy med diameter på 20-100 μm.
Akutt alveolarhypoksi forårsaker lungevaokonstriksjon (HPV) – også kjent som von Euler-Liljestrand-mekanismen – som tjener til å matche lungeperfusjon med ventilasjon. Frem til nå er de underliggende mekanismene ikke fullt ut forstått. Det viktigste vaskulære segmentet som bidrar til HPV er den intra-acinare arterien. Denne karseksjonen er ansvarlig for blodtilførselen av en individuell acinus, som er definert som den delen av lungen som er distal til en terminal bronkiol. Intra-acinar arterier er for det meste plassert i den delen av lungen som ikke kan nås selektivt av en rekke ofte brukte teknikker som måling av lungearterietrykket i isolerte perfused lunger eller kraftopptak fra dissekerte proksimale lungearteriesegmenter1,2. Analysen av subpleurale kar ved sanntids konfomisk laserskanning luminescensmikroskopi er begrenset til kar med opptil 50 μm i diameter3.
Vi tilbyr en teknikk for å studere HPV av murin intrapulmonale arterier i området 20-100 μm indre diametre. Den er basert på videomorfometrisk analyse av tverrsnittsarterier i presisjonskuttede lungeskiver (PCLS). Denne metoden tillater kvantitativ måling av vasoreaktivitet av små intra-acinar arterier med indre diameter mellom 20-40 μm som ligger ved kiler av alveolar septa ved siden av alveolar kanaler og av større pre-acinar arterier med indre diametre mellom 40-100 μm som går ved siden av bronki og bronkioler. I motsetning til sanntidsavbildning av subpleurale kar i bedøvede og ventilerte mus, oppstår videomorfometrisk analyse av PCLS under forhold uten skjærspenning. I vår eksperimentelle modell viser begge arterielle segmenter en monofasisk HPV når de utsettes for middels gasset med 1% O2 og responsen falmer etter 30-40 min ved hypoksi.
I de fleste systemiske vaskulære senger hypoksi induserer vaskodilatasjon, i forhold til vasokonstriksjon forårsaket av hypoksi i lungevaskulaturen. Denne lungespesifikke responsen på senket oksygenspenning kalles hypoksisk lungevaokonstriksjon (HPV), utbrudd i løpet av sekunder og reverserer raskt etter tilbakekobling til normoksisk ventilasjon. Selv om HPV er kjent i mer enn 60 år, er de cellulære oksygensensorene og signalkaskaden(e) som resulterer i vasokonstriksjon fortsatt under debatt. Det er en relativ bred enighet om at hypoksi-fremkalte redoks- og ROS-endringer er avgjørende for HPV og utvikling av lungehypertensjon (gjennomgått i Sylvester et al. 4 og Schumacker et al. 5). Våre egne data støtter en sentral rolle i komplekse II av mitokondrie respiratorisk kjede i HPV6,7. Nylig, Wang et al. presenterte et helt nytt konsept for oksygenmåling og HPV: Basert på deres data foreslår de at alveolar hypoksi er følt av de tilstøtende kapillærene som forårsaker membrandepolarisering av endotelcellene. Responsen forplantes via connexion 40 gapkryss av endotelcellene som fører til innsnevring av glatte muskelceller av oppstrøms arterioler8.
Lungenes arterier løper langs luftveiene, forgrener seg med dem, reduserer kontinuerlig i diameter, og til slutt leverer blod til kapillærsystemet som ligger i alveolarveggene. Denne arterielle sirkulasjonen består av anatomisk og funksjonelt distinkte segmenter. De proksimale kanalarteriene, preget av en overflod av elastiske fibre i veggene, etterfølges av fullt muskulære intrapulmonale arterier som i stor grad kontrollerer lungevaskulær motstand. Trinn for trinn går disse arteriene inn i segmenter der muskellaget blir ufullstendig, og til slutt er karene fri for glatte muskel actin-immunoreaktive celler. Den intra-acinare arterien som fôrer en individuell lungeacinus med blod representerer et delvis muskuløst segment6. På samme måte representerer lungearterialsystemet ikke en ensartet struktur angående hypoksisk respons, men viser markert regionalt mangfold9,10. For eksempel, i proksimale lungearterier isolert fra rotte lunger hypoksi induserer en bifasisk respons, viser en innledende rask sammentrekning av kort varighet som – etter ufullstendig avslapning – etterfølges av en annen langsom, men vedvarende sammentrekning11. I resistensarterier isolert fra rotte lungeparenchyma som fjerde- og femte divisjon av lungearterier (ekstern diameter <300 μm), forårsaker hypoksi monofasisk innsnevring9. Allerede i 1971 konkluderte Glazier og Murray med målinger av endringer i kapillær rød blodlegemekonsentrasjon i lunger av hunder ventilert med hypoksiske gassblandinger at den hypoksiinduserte økningen i vaskulær motstand hovedsakelig skjedde oppstrøms for kapillærene12. I dag representerer intravital mikroskopi av intakte lunger av bedøvede og mekanisk ventilerte mus et kraftig verktøy for analyse av lungemikrovaskulaturen13,14. Eksisjon av et sirkulært vindu i thoracic veggen gir mikroskopisk tilgang til overflaten av lungen og tillater analyse av subpleurale lungekar med opptil 50 μm i diameter. Ved å kombinere denne teknikken med infusjonen av FITC-dextran, Tabuchi et al. vist at bare mellomstore arterioler med diameter på 30-50 μm viser en markert respons på hypoksi som opprettholdt over en periode på 60 min med en mindre demping etter 30 minutter. I motsetning viste små arterioler med diameter på 20-30 μm bare en mindre respons på hypoksi3. Denne teknikken tillater imidlertid ikke analyse av arterier med større diameter som 50 μm siden disse karene ligger for dypt i lungevevet.
For å bygge bro over gapet i analysen av store og svært små lungearterier (som de subpleurale karene) av murin lunger, vedtok vi en metode som ble beskrevet av Martin et al. for analyse av reaktivitet av luftveiene15. Basert på en agarose gel instilling teknikk, det letter forberedelsen av presisjon kuttet lunge skiver (PCLS) fra dette relativt myke og elastiske organet. Innenfor PCLS vasoreaktivitet av tverrsnitt arterier med indre diameter mellom 20-100 μm kan observeres direkte ved videomikroskopi. Påføring av legemidler under hypoksisk inkubasjon av PCLS tillater analyse av deres effekter på HPV. Det er spesielt viktig at denne teknikken også kan brukes på genetisk konstruert mus. Basert på deres plassering i lungen klassifiserer vi arteriene som pre- og intra-acinar kar, med indre diametre på henholdsvis 20-40 μm og 40-100 μm. Under en funksjonell visning leverer den intra-acinare arterien en individuell lungeacinus med blod, og pre-acinar arterien er de foregående karseksjonene. Opptak av bilder på et digitalt kamera tillater etterfølgende kvantifisering av vasoreaction. En åpenbar egenskap ved denne PCLS-modellen er mangelen på skjærstress som virker på endotelet. I perfunderte kar fører akutt HPV derimot til en økning i skjærstress og dermed indusere sekundære mekanismer som NO release16. I tillegg tillater bruk av PCLS målinger av HPV uten ekstrapulmonale nevrale eller hormonelle påvirkninger. I motsetning til cellekultursystemer, for eksempel tilberedt fra hundepulmonale arterielle glatte muskelceller17, er karveggens histologiske arkitektur nesten helt bevart.
Oppsummert gir denne protokollen en nyttig metode for analyse av potensielle molekylære oksygensensorer og / eller cellulære veier som er ansvarlige for HPV av intrapulmonale arterier med indre diametre mellom 20-100 μm under forhold uten skjærspenning.
Den isolerte ventilerte og perfunderte muse lungen er en utmerket modell for analyse av den fysiologiske responsen til lungevaskulærsystemet på endringer i oksygentilførselen og tillater blant annet kontinuerlig måling av lungearterialtrykket1. Denne modellen tillater imidlertid ikke identifisering og analyse av de vaskulære segmentene som viser den sterkeste responsen på hypoksi. Dette er fordelen med vår videomorfometriske analyse av PCLS som letter måling av HPV av individuelle arterier med indre diametre på 20-100 μm. PCLS representerer en attraktiv in vitro-modell siden de ligner på orgelet de er forberedt fra. I motsetning til cellekultursystemer er alle celletyper til stede i den opprinnelige vevsmatrisekonfigurasjonen. Videre er en lunge tilstrekkelig for fremstilling av mange PCLS, slik at minst delvis eksperimenter kan standardiseres ved bruk av seksjoner fra samme mus. Ifølge 3R-konseptet (reduksjon, raffinement og erstatning av laboratoriedyr i livsvitenskapen) til Russell og Burch23 argumenterer dette faktum også for bruk av PCLS.
Imidlertid må man huske på at vevet er skadet ved å kutte med en vibratom og langsgående signalering for eksempel via endotelcellene som postulert av Kübler et al. 14 er ikke lenger mulig.
I utgangspunktet ble PCLS hovedsakelig brukt til biokjemiske, farmakologiske og toksikologiske studier, men i mellomtiden brukes de også til måling av bronkial kontraktilitet, mucociliary funksjon og vaskulære responser (for vurderinger se Sanderson20 og Davies21). Holdt et al. har utført en studie der de sammenlignet modellene av isolert perfundert og ventilert mus lunge og av PCLS24. De fant ved analyse av responsen fra luftveier og lungefartøy til en rekke endogene mediatorer at viktige egenskaper ved hele lungen ble opprettholdt i PCLS.
I PCLS etableres ikke hypoksiske forhold via luftveiene som i den intakte lungen, men ved inkubasjon av lungeseksjonen i hypoksisk gasset medium. Vi har analysert oksygen partielt trykk (pO2) av medium pregassed med 1% O2,5.3% CO2,93.7% N2 og med 21% O2,5.3% CO2,73.7% N2, henholdsvis ved hjelp av en blodgass analysator. Umiddelbart før du matet den inn i perfusjonskammeret, var pO2 av den hypoksiske gassede MEM 40 mmHg og den av det normoksiske gassede mediet 160 mmHg6. I den intakte lungen HPV induseres når alveolar pO2 faller under 50 mmHg25, en situasjon som åpenbart kan etterlignes ved påføring av hypoksisk gasset medium. Våre data om omfanget av HPV samsvarer godt med resultater oppnådd med en annen eksperimentell tilnærming. Yamaguchi et al. har påført isolerte rotte lunger for å undersøke mikrovessels med diameter på 20-30 μm ved sanntid konfokal laser skanning luminescens mikroskopi koblet til et høysensitivt kamera med en bildeforsterker10. De observerte en gjennomsnittlig reduksjon i diameter på 2,7 μm etter eksponering av lungene til hypoksi. Man kan beregne at en 20% reduksjon av lysområdet når vi måler det i systemet vårt tilsvarer ca 15% reduksjon i diameter.
I våre eksperimenter har vi klassifisert arteriene som henholdsvis pre- og intra-acinar kar, med indre diametre på 40-100 μm og 20-40 μm. Hos mennesker skjer overgangen fra muskulære til ikke-muskulære arterier i diameterområdet 70-100 μm. Hos mus er glatte muskelceller til stede ned til en ekstern diameter på 20 μm26. Av denne grunn er det ikke mulig å analysere arterier med diametre under 20 μm siden de ikke kan identifiseres basert på fasekontrastbildet. I den andre enden av skalaen er fartøy med diameter over 100 μm neppe å finne i PCLS og ofte strippet fra det omkringliggende vevet.
Faktisk diskuteres en rekke molekylære kandidater som molekylære oksygensensorer eller som en del av signalkaskaden som resulterer i HPV (for en gjennomgang se Sylvester et al. 4). Når passende knockoutmus er tilgjengelig, kan videomorfometri brukes til analyse av vasoreaktivitet av pre- og intraacinære arterier sammenlignet med ville dyr. PCLS har imidlertid også blitt brukt til andre problemer: Faro et al. brukte dem til å karakterisere utviklingen av endotelavhengig utvidelse i lunge etter fødselen29 og PCLS tilberedt fra marsvin utsatt for røyk eller luft daglig i 2 uker ble brukt til å demonstrere virkningen av sigarettrøyk på vasoreaktivitet via induksjon av endotel dysfunksjon30.
Kritiske trinn i protokollen
I våre eksperimenter klassifiserte vi arteriene som pre-acinar (indre diametre på 40-100 μm) og intra-acinar (indre diametre på 20-40 μm). Spesielt for fremstilling av lungeseksjoner som skal brukes til analyse av større fartøy, er det viktig å legge natriumnitroprusside til perfusjonsbufferen. Dette stoffet forhindrer sammentrekning av karene under prøvepreparatet og dermed deres rip off fra det omkringliggende vevet som fører til ufullstendig vasodilatasjon. Natriumnittroprusside i perfusjonsbufferen er ikke så viktig for fremstilling av lungeseksjon som skal brukes til analyse av små arterier fordi de er sterkt forankret til alveolar septa.
Alle eksperimenter bør startes med inkubasjoner der reaktivitet av arteriene testes. Sjelden fikk vi lungepreparater der ingen respons av fartøy til entreprenører eller dilatatorer var påviselig. Vi vet ikke årsaken til dette: Kan være at volumet av agarose fylt i lungene var for stort eller for lavt, slik at kutting av orgelet i PCLS ikke var optimalt. Alternativt er det tenkelig at agarose var avkjølt for fort under innåndingsprosedyren, noe som resulterte i skadelig skjærspenning. I tilfelle at i en individuell PCLS er ingen levedyktig arterie detekterbar, må delen kastes og erstattes av en annen.
Beslutningen om levedyktigheten til en arterie ble tatt basert på responsen på U46619. Påføring av U46619 i en konsentrasjon på 0,1 μM induserer en vasokonstriksjon som – etter litt trening – er synlig direkte i bildesekvensen på skjermen. Siden det er noen varianser i vasoreaktiviteten, undersøker vi virkningen av et stoff på HPV ved å måle vasoresponsen i lungeseksjoner utsatt for stoffet eller til mediet alene i sin tur.
HPV av en individuell arterie er ofte neppe påviselig i mikroskopet, og i gjennomsnitt resulterer det i en reduksjon av lysområdet på ca 20-30%. Imidlertid har små endringer i diameteren til en arterie en tydelig inngang på strømningsmotstand. I henhold til ligningen “R = 1/r4” med R = motstand og r = radius, er strømningsmotstanden omvendt proporsjonal med radiusens fjerde kraft. La meg gi et eksempel: En “ideell arterie” som viser et sirkulært tverrsnitt med en diameter på 40 μm (r = 20 μm) har et lysområde på ca 1260 μm2. Når lysområdet reduseres med 20%, kan vi beregne at fartøyets diameter reduseres med 10,5% til 35,8 μm (r = 17,9 μm). Ifølge ligningen gitt ovenfor, vil strømningsmotstanden til dette fartøyet øke fra 6,25 x 10-6 til 9,71 x 10-6 som er med ca. 55%. Ved en reduksjon av lysområdet med 30% ville radiusen reduseres med ca 16%, men strømningsmotstanden vil øke med ca 100%. Selv om disse beregningene er en forenkling der en laminær blodstrøm og en karform av et stivt rør antas, er det antydende virkningen av allerede mindre endringer i diameteren på strømningsmotstanden.
The authors have nothing to disclose.
Denne forskningen er sponset av Excellence Cluster Cardio-Pulmonary System.
Vibratome "Microm HM 650 V" | Microm/Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | ||
Microwave oven | Bosch, Frankfurt, Germany | HMT 702C | |
Heating cabinet | Heraeus/Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | ||
Flow-through superfusion chamber | Hugo Sachs Elektronik, March, Germany | PCLS-Bath Type: 847 SN:4017 | |
Upright inverted microscope equipped with 4X, 10X, 20X, and 40X objectives | Leica, Wetzlar, Germany | ||
CCD-camera | Stemmer Imaging, Puchheim, Germany | ||
Peristaltic pump Minipuls 3 | Gilson, Limburg-Offheim, Germany | ||
Water bath “Universal Wasserbad Isotem 205” | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | 9452450 | |
Gas tight tubes Tygon R3603-13 Øi: 3/32 in, Øa: 5/32 in, wall: 1/32 in | VWR, Darmstadt, Germany | ||
Various scissors and forceps | |||
Sewing cotton | |||
2 ml Syringe | Braun-Melsungen AG, Melsungen, Germany | ||
50 ml Syringe | Braun-Melsungen AG, Melsungen, Germany | ||
Flexible plastic pipe of an IV indwelling cannula “IntrocanR-W” (cannula 20 G x 1 ¼ in, 1.1 x 32 mm) | Braun-Melsungen AG, Melsungen, Germany | 4254112B | For instillation of the agarose into the lung |
Cannula 21 G x 4 ¾ in; 0.8 x 120 mm | Braun-Melsungen AG, Melsungen, Germany | 4665643 | For bubbling of the medium |
Cannula Nr. 17, 24 G x 1, 0.55 x 25 mm | Terumo, Eschborn, Germany | NN 2425 88DSF18 | For lung perfusion |
Normoxic gas mixture (21% O2, 5.3% CO2, 73.7% N2) | Linde, Hildesheim, Germany | ||
Hypoxic gas mixture (1% O2, 5.3% CO2, 93.7% N2) | Linde, Hildesheim, Germany | ||
HEPES | Sigma, Deisenhofen, Germany | H 4034 | |
NaCl | Roth, Karlsruhe, Germany | 3957.1 | |
KCl | Merck, Darmstadt, Germany | 1.04936.0500 | |
MgCl2•6H2O | Merck, Darmstadt, Germany | 1.05833.0250 | |
CaCl2•2H2O | Merck, Darmstadt, Germany | 1.02382.0500 | |
Glucose D-(+) | Sigma, Deisenhofen, Germany | G 7021 | |
Low melting point agarose | Bio-Rad, Munich, Germany | 161-3111 | |
Heparin-sodium | Ratiopharm, Ulm, Germany | 5120046 | |
Phenolred-free minimal essential medium (MEM) | Invitrogen, Darmstadt, Germany | 5120046 | |
70% EtOH for desinfection | Stockmeier Chemie, Dillenburg, Germany | ||
Superglue | UHU, Bühl/Baden, Germany or from a supermarket | ||
U46619 (a thromboxane analog) | Calbiochem/Merck, Darmstadt, Germany | 538944 | |
Sodium nitroprusside (Nipruss) | Schwarz Pharma, Monheim, Germany | 5332804 | |
Optimas 6.5 software | Stemmer, Puchheim, Germany | ||
SPSS 19 | AskNet, Karlsruhe, Germany |