הערכת myogenic תגובה וVasoactivity בעורקי ההתנגדות mesenteric שימוש Myography לחץ
Summary
myography לחץ משמש כדי להעריך vasoactivity של עורקים קטנים המתפתחים התכווצות מתמשכת כאשר לחץ. כתב יד זה מספק פרוטוקול מפורט להעריך במגזרים בודדים של עורקי mesenteric קטנים מחולדות, vasoactivity ואת ההשפעה של לחץ intraluminal על קוטר כלי דם.
Abstract
עורקי התנגדות קטנים להצר ולהרחיב בהתאמה בתגובה לעלייה או ירידה בלחץ intraluminal; תופעה זו ידועה כתגובת myogenic היא רגולטור מרכזי של זרימת דם מקומית. בתנאי isobaric עורקי התנגדות קטנים לפתח ספגו התכווצות הידועה כטון myogenic (MT), אשר הוא הקובע עיקרי של התנגדות המערכתית של כלי דם (SVR). מכאן, הכנות בלחץ vivo לשעבר של עורקי התנגדות קטנים הן כלים עיקריים ללמוד לתפקד כלי דם במדינות קרובים-פיסיולוגיות. כדי להשיג זאת, קטע שלם מבודד טרי של עורק קטן התנגדות (קוטר ~ 260 מיקרומטר) הוא רכוב על שתי קנולות זכוכית קטנה ודחוסות. הכנות עורקים אלה לשמר ביותר במאפייני vivo והערכת היתר של טון של כלי דם בזמן אמת. כאן אנו מספקים פרוטוקול מפורט להערכת vasoactivity בעורקי mesenteric ההתנגדות קטנות בלחץ מחולדות; עורקים אלה לפתחהתכווצות כלי דם מתמשך – כ -25% מקוטר מקסימאלי – כאשר לחץ על 70 מ"מ כספית. הכנות עורקים אלה ניתן להשתמש כדי לחקור את ההשפעה של תרכובות מחקריות על קשר בין לחץ וvasoactivity התוך עורקים ולקבוע שינויים בתפקוד כלי דם במודלים של בעלי חיים במחלות שונות.
Introduction
עורקי התנגדות קטנים הם גורמים עיקריים של SVR ולשחק תפקיד חשוב בפתופיזיולוגיה של מחלות רבות 1,2. תנאים כגון סוכרת 3, הריון 4, איסכמיה reperfusion 5, השמנת יתר ולחץ דם 6,7 לעתים קרובות קשורים בתפקוד כלי דם שונה. myography כלי דם לא יכול רק לספק תובנות חשובות שינויים בתפקוד כלי דם במחלות שונות, אלא גם לסייע בזיהוי מטרות טיפוליות ולהעריך את היעילות של תרכובות vasoactive. תפקוד כלי דם נחקר באמצעות עורקים קטנים מבודדים בתנאי כלי איזומטרי או isobaric 8. תיאור מפורט של myography איזומטרי מסופק במקום אחר 9. עם זאת יש הבדלים בנתונים המתקבלים מאיזומטרי לעומת הכנות isobaric 10-12. מאז הכנות עורקים בלחץ תאפשר המחקר של פונקצית כלי דם בתנאים קרובים-פיסיולוגיים,ממצאים שהתקבלו עשויים להיות מתואמים טובים יותר עם התנהגות של מיטת כלי דם 8,13 in vivo.
בשינה 1902 בייליס תואר לראשונה את ההשפעה של לחץ transmural בקוטר כלי דם 14. הוא נצפה בעורקי התנגדות קטנים מהמיטות כלי דם שונות של ארנבים, חתולים וכלבים שירידה בלחץ בעקבות התרחבות, ועלייה בלחץ בעקבות התכווצות כלי דם. תופעה זו ידועה בשם תגובת myogenic. בייליס וחוקרים שלאחר מכן הבחינו כי בתנאי isobaric עורקי התנגדות קטנה לפתח התכווצות מתמשכת הידועה כMT 15,16. שתי תגובת myogenic וMT ניתן להעריך באמצעות myography לחץ טכניקה (PM). PM משמש בעיקר כדי לקבוע vasoactivity של עורקים קטנים, ורידים וכלי שיט אחרים. בנוסף להערכת ההשפעה של תרכובות vasoactive בקוטר כלי דם, אחר הצהריים – כשמו מציין – משמש כדי להעריך CH-תיווך לחץ תוך-Anges בקוטר כלי דם. במהלך העשורים האחרונים התקדמות בתוכנת מחשב, שמשופרות מיקרוסקופיה הווידאו ופיפטה הזכוכית מושכים קדימה, עשו PM קל יותר לבצע. עם זאת, דיסקציה של מגזרים שלמים קיימא של כלי דם קטנים נשארה מייגע ולעתים מאתגרת. כאן אנו מתארים פרוטוקול מפורט ללמוד תגובת myogenic בעורקי התנגדות mesenteric הקטנים המבודדים מחולדות.
Protocol
Representative Results
Discussion
צעדים, פתרון בעיות ושינויים קריטיים
בהכנת כלי isobaric טיפוסית, העורק בלחץ על 70 מ"מ כספית בין שתי קנולות זכוכית perfused עם PSS החם (37 מעלות צלזיוס). לאחר 30-45 דקות, עורקים לפתח MT, מאופיינים בירידה ספונטנית בקוטר שמייצבת ב20-30 דקות. עורקי ההתנג…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Sandeep Khurana נתמכת על ידי NIH (K08DKO81479). Vikrant Rachakonda נתמך על ידי (T32DK067872).
Materials
| Chemical | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Acetylcholine | Sigma Aldrich | A6625 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Calcium chloride (CaCl2) | Sigma Aldrich | 223506 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| D-(+)-Glucose | Sigma Aldrich | G5767 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N’,N’-tetra acetic acid (EGTA) | Sigma Aldrich | E3889 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Ethylene diamine tetra acetic acid (EDTA) | Sigma Aldrich | E9884 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| HEPES | Sigma Aldrich | H3784 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Magnesium sulfate (MgSO4) | Sigma Aldrich | M7506 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| MOPS | Sigma Aldrich | M5162 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Phenylephrine | Sigma Aldrich | P6126 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Potassium chloride (KCl) | Sigma Aldrich | P3911 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Potassium phosphate (KH2PO4) | Sigma Aldrich | P5655 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Sodium bicarbonate (NaHCO3 ) | Sigma Aldrich | S6014 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma Aldrich | S7653 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma Aldrich | S5881 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Sodium nitroprusside | Sigma Aldrich | 13451 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Sodium phosphate monobasic monohydrate (NaH2PO4) | Sigma Aldrich | S9638 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Sodium pyruvate | Sigma Aldrich | P8574 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Table 1. | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Table 2. Composition of Experimetnal solutions | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Equipment | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| CCD Monochrome Camera | The imaging Source | DMK 21AU04 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Single inline solution heater | Warner Instruments | 64-0102 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Thermistor | Warner Instruments | 64-0108 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Dual automatic temperature controller | Warner Instruments | TC-344B | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Flaming/Brown micropipette puller | Sutter Instruments | P-97 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Fluorescence System Interface | IonOptix | model FSI-700 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Forceps and scissors | World Precision Instruments | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Ion Wizard-Core and Analysis | IonOptix | Ion Wizard 6.0 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Laboratory tubing | Silastic | 508-005 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Male Sprague Dawley rat | Harlan Laboratories | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Master flex console drive | Cole-parmer | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Milli-Q Plus Ultrapure Water System | Millipore | ZD5211584 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Ophthalmic monofilament nylon suture | Ethicon | 9007G | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Photometry and Dimensioning Microscope | Motic | AE31 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Pressure Servo Controller with peristaltic pump and pressure transducer | Living Systems Instrumentation | PS-200 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Stereomicroscope | Nikon Instruments Inc | SMZ660 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Vessel Chamber | Living Systems Instrumentation | CH-1 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Dissection dish | Living Systems Instrumentation | DD-90-S | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Thin Wall Glass Capillaries | World Precision Instruments | TW120-6 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Microforge | Stoelting | 51550 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Table 3. |
References
- Christensen, K. L., Mulvany, M. J. Location of resistance arteries. J Vasc Res. 38, 1-12 (2001).
- Rietzschel, E. R. Oxidized low-density lipoprotein cholesterol is associated with decreases in cardiac function independent of vascular alterations. Hypertension. 52, 535-541 (2008).
- Hill, M. A., Ege, E. A. Active and passive mechanical properties of isolated arterioles from STZ-induced diabetic rats. Effect of aminoguanidine treatment. Diabetes. 43, 1450-1456 (1994).
- Osol, G., Cipolla, M. Interaction of myogenic and adrenergic mechanisms in isolated, pressurized uterine radial arteries from late-pregnant and nonpregnant rats. Am J Obstet Gynecol. 168, 697-705 (1993).
- Cipolla, M. J., McCall, A. L., Lessov, N., Porter, J. M. Reperfusion decreases myogenic reactivity and alters middle cerebral artery function after focal cerebral ischemia in rats. Stroke. 28, 176-180 (1997).
- Ren, Y., et al. Enhanced myogenic response in the afferent arteriole of spontaneously hypertensive rats. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 298, H1769-H1775 (2010).
- Hayashi, K., Epstein, M., Saruta, T. Altered myogenic responsiveness of the renal microvasculature in experimental hypertension. J Hypertens. 14, 1387-1401 (1996).
- Schubert, R., Mulvany, M. J. The myogenic response: established facts and attractive hypotheses. Clin Sci (Lond). 96, 313-326 (1999).
- Bridges, L. E., Williams, C. L., Pointer, M. A., Awumey, E. M. Mesenteric artery contraction and relaxation studies using automated wire myography. J Vis Exp. , (2011).
- Buus, N. H., Vanbavel, E., Mulvany, M. J. Differences in Sensitivity of Rat Mesenteric Small Arteries to Agonists When Studied as Ring Preparations or as Cannulated Preparations. British Journal of Pharmacology. 112, 579-587 (1994).
- Falloon, B. J., Stephens, N., Tulip, J. R., Heagerty, A. M. Comparison of small artery sensitivity and morphology in pressurized and wire-mounted preparations. Am J Physiol. 268, H670-H678 (1995).
- Schubert, R., Wesselman, J. P. M., Nilsson, H., Mulvany, M. J. Noradrenaline-induced depolarization is smaller in isobaric compared to isometric preparations of rat mesenteric small arteries. Pflugers Archiv-European Journal of Physiology. 431, 794-796 (1996).
- Khurana, S., Raina, H., Pappas, V., Raufman, J. P., Pallone, T. L. Effects of deoxycholylglycine, a conjugated secondary bile acid, on myogenic tone and agonist-induced contraction in rat resistance arteries. PLoS One. 7, e32006 (2012).
- Bayliss, W. M. On the local reactions of the arterial wall to changes of internal pressure. J Physiol. 28, 220-231 (1902).
- Hughes, J. M., Bund, S. J. Arterial myogenic properties of the spontaneously hypertensive rat. Exp Physiol. 87, 527-534 (2002).
- Mulvany, M. J., Halpern, W. Mechanical properties of vascular smooth muscle cells in situ. Nature. 260, 617-619 (1976).
- Raina, H., Zacharia, J., Li, M., Wier, W. G. Activation by Ca2+/calmodulin of an exogenous myosin light chain kinase in mouse arteries. J Physiol. 587, 2599-2612 (2009).
- Fenger-Gron, J., Mulvany, M. J., Christensen, K. L. Mesenteric blood pressure profile of conscious, freely moving rats. J Physiol. 488 (Pt 3), 753-760 (1995).
- Davis, M. J., Hill, M. A. Signaling mechanisms underlying the vascular myogenic response). Physiol Rev. 79, 387-423 (1999).
- Osmond, J. M., Mintz, J. D., Dalton, B., Stepp, D. W. Obesity increases blood pressure, cerebral vascular remodeling, and severity of stroke in the Zucker rat. Hypertension. 53, 381-386 (2009).
- Ge, Y., et al. Endogenously produced 20-HETE modulates myogenic and TGF response in microperfused afferent arterioles. Prostaglandins Other Lipid Mediat. 102-103, 42-48 (2013).
- Ryan, M. J., et al. Placental ischemia impairs middle cerebral artery myogenic responses in the pregnant rat. Hypertension. 58, 1126-1131 (2011).
- Bagi, Z., et al. Type 2 diabetic mice have increased arteriolar tone and blood pressure: enhanced release of COX-2-derived constrictor prostaglandins. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 25, 1610-1616 (2005).
