Evaluar Miogénica Respuesta y Vasoactividad En arterias mesentéricas Resistencia Usando Miografía Presión

Summary

Miografía de presión se utiliza para evaluar vasoactividad de las pequeñas arterias que se desarrollan constricción sostenida cuando se presuriza. Este manuscrito proporciona un protocolo detallado para evaluar en segmentos aislados de pequeñas arterias mesentéricas de ratas, vasoactividad y el efecto de la presión intraluminal del diámetro vascular.

Abstract

Arterias de resistencia pequeños constreñir y dilatar, respectivamente, en respuesta a un aumento o disminución de la presión intraluminal; este fenómeno se conoce como respuesta miogénica es un regulador clave del flujo sanguíneo local. En condiciones isobáricas arterias de resistencia pequeños desarrollan sostenidas constricción conocido como tono miogénico (MT), que es un importante factor determinante de la resistencia vascular sistémica (SVR). Por lo tanto, los preparativos ex vivo a presión de las arterias de resistencia pequeñas son las principales herramientas para el estudio de la función microvascular en estados-cerca fisiológica. Para lograr esto, un segmento intacto recién aisladas de una arteria resistencia pequeña (diámetro ~ 260 micras) se monta sobre dos cánulas pequeño de vidrio y presurizado. Estas preparaciones arteriales conservan la mayor parte en las características in vivo y evaluación permiso del tono vascular en tiempo real. Aquí le ofrecemos un protocolo detallado para evaluar vasoactividad en presurizadas pequeñas arterias mesentéricas de resistencia de ratas; estas arterias desarrollanvasoconstricción sostenida – aproximadamente 25% del diámetro máximo – cuando presuriza a 70 mmHg. Estas preparaciones arteriales se pueden utilizar para estudiar el efecto de compuestos en investigación sobre la relación entre la presión intra-arterial y vasoactividad y determinar cambios en la función microvascular en modelos animales de diversas enfermedades.

Introduction

Arterias de resistencia pequeños son los principales determinantes de la SVR y desempeñan un papel importante en la patofisiología de muchas enfermedades ^1,2. Condiciones como la diabetes ^3, embarazo ^4, isquemia-reperfusión ^5, la obesidad y la hipertensión ^6,7 se asocian frecuentemente con la función microvascular alterado. Miografía vascular no sólo puede proporcionar importantes conocimientos sobre los cambios en la función microvascular en diversas enfermedades, sino también ayudar a identificar dianas terapéuticas y evaluar la eficacia de los compuestos vasoactivos. La función vascular se ha estudiado el uso de pequeñas arterias aisladas en condiciones de buques isométricos o isobáricas ^8. Descripción detallada de miografía isométrica se proporciona en otro lugar ^9. Sin embargo, hay diferencias en los datos obtenidos a partir de isométrica frente a preparaciones isobáricas ^10-12. Desde preparaciones arteriales presurizados permiten el estudio de la función microvascular en condiciones casi fisiológicas, lahallazgos obtenidos pueden correlacionarse mejor con el comportamiento in vivo de la cama vascular ^8,13.

En 1902 Bayliss descrita por primera vez el efecto de la presión transmural del diámetro vascular ^14. Se observó en pequeñas arterias de resistencia de diversos lechos vasculares de los conejos, gatos y perros que una disminución en la presión fue seguido por la vasodilatación y un aumento en la presión fue seguido por la vasoconstricción. Este fenómeno se conoce como respuesta miogénica. Bayliss y posteriores investigadores observaron que, en condiciones isobáricas arterias pequeña resistencia desarrollan constricción sostenida conocida como MT ^15,16. Tanto la respuesta miogénica y MT pueden ser evaluados utilizando miografía presión (PM) técnica. PM se utiliza principalmente para determinar vasoactividad de pequeñas arterias, venas y otros vasos. Además de evaluar el efecto de compuestos vasoactivos en diámetro vascular, PM – como su nombre indica – se utiliza para evaluar ch presión intravascular mediadaanges en el diámetro vascular. Durante las últimas décadas los avances en los programas informáticos, que mejoran la microscopía de vídeo y pipeta de vidrio tirando, han hecho PM más fácil de realizar. Sin embargo, la disección de los segmentos intactos viables de pequeños vasos sanguíneos sigue siendo tedioso ya veces difícil. Aquí describimos un protocolo detallado para estudiar la respuesta miogénica en pequeñas arterias mesentéricas de resistencia aislados de ratas.

Protocol

Los ejemplos que se muestran aquí son de experimentos aprobados por IACUC en Georgia Regents de la Universidad – Protocolo nº: # 2011-0408 1. Preparación de los reactivos Prepare la solución de la disección de almacén: Para 500 ml de solución madre de disección (5x), se disuelven 21,18 g de NaCl, 0,875 g de KCl, 0,739 g MgSO4, 1,049 g MOPS y 0,019 g de EDTA en 450 ml de agua Milli-Q. Ajustar el pH a 7.3 a 7.4 utilizando 1 N NaOH. Completar el volumen hasta 500 m…

Representative Results

Representación esquemática de un myograph presión típica configuración se muestra en la Figura 1. Los dos extremos de la embarcación se canulan con una micropipeta de vidrio y se aseguran con suturas en ambos lados. Via tubería y una llave de paso abierto, una cánula está conectado a un regulador de presión servo-controlado; la otra cánula está conectado a una llave de paso cerrada. La cámara se perfundió con son observados por un microscopio invertido conectado a una cámara CCD PSS y di?…

Discussion

Pasos crítico, solución de problemas y modificaciones

En una preparación típica embarcación isobárica, la arteria se presuriza a 70 mmHg entre dos cánulas de vidrio perfundidos con agua tibia (37 ° C) PSS. Después de 30-45 min, arterias desarrollan MT, caracterizado por disminución espontánea de diámetro que se estabiliza en 20-30 min. Las arterias de resistencia de varios lechos vasculares desarrollan MT variable. Por ejemplo la resistencia de rata arterias mesentéricas desarrolla…

Materials

			Chemical
Acetylcholine	Sigma Aldrich	A6625
Calcium chloride (CaCl2)	Sigma Aldrich	223506
D-(+)-Glucose	Sigma Aldrich	G5767
Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N’,N’-tetra acetic acid (EGTA)	Sigma Aldrich	E3889
Ethylene diamine tetra acetic acid (EDTA)	Sigma Aldrich	E9884
HEPES	Sigma Aldrich	H3784
Magnesium sulfate (MgSO4)	Sigma Aldrich	M7506
MOPS	Sigma Aldrich	M5162
Phenylephrine	Sigma Aldrich	P6126
Potassium chloride (KCl)	Sigma Aldrich	P3911
Potassium phosphate (KH2PO4)	Sigma Aldrich	P5655
Sodium bicarbonate (NaHCO3 )	Sigma Aldrich	S6014
Sodium chloride (NaCl)	Sigma Aldrich	S7653
Sodium hydroxide (NaOH)	Sigma Aldrich	S5881
Sodium nitroprusside	Sigma Aldrich	13451
Sodium phosphate monobasic monohydrate (NaH2PO4)	Sigma Aldrich	S9638
Sodium pyruvate	Sigma Aldrich	P8574
			Table 1.
			Physiological salt solution (1000 ml) mM KCl 4.9 0.365 g NaCl 112 6.545 g MgSO4.7H2O 1.2 0.296 g KH2PO4 1.2 0.163 g Glucose 11.5 2.072 g NaHCO3 26 2.184 g HEPES 10 2.383 g CaCl2 2 2 ml (1M stock) De-ionized water 998 ml Ca2+ free physiological salt solution (100 ml) mM KCl 4.9 0.036 g NaCl 112 0.645 g MgSO4.7H2O 1.2 0.029 g KH2PO4 1.2 0.016 g Glucose 11.5 0.207 g NaHCO3 26 0.218 g HEPES 10 0.238 g EGTA 0.39 0.015 g Sodium nitroprusside 0.1 0.0026 g De-ionized water 100 ml Dissection solution, stock (500 ml) mM NaCl 145 21.18 g KCl 4.7 0.875 g MgSO4 1.2 0.739 g MOPS 2 1.049 g EDTA 0.02 0.019 g De-ionized water 500 ml Working dissection solution (100 ml) mM Dissection solution stock 20 ml Glucose 1.2 0.091 g NaH2PO4 5 0.016 g Sodium pyruvate 2 0.022 g CaCl2 2 0.2 ml (1M stock) De-ionized water 79.8 ml
			Table 2. Composition of Experimetnal solutions
			Equipment
CCD Monochrome Camera	The imaging Source	DMK 21AU04
Single inline solution heater	Warner Instruments	64-0102
Thermistor	Warner Instruments	64-0108
Dual automatic temperature controller	Warner Instruments	TC-344B
Flaming/Brown micropipette puller	Sutter Instruments	P-97
Fluorescence System Interface	IonOptix	model FSI-700
Forceps and scissors	World Precision Instruments
Ion Wizard-Core and Analysis	IonOptix	Ion Wizard 6.0
Laboratory tubing	Silastic	508-005
Male Sprague Dawley rat	Harlan Laboratories
Master flex console drive	Cole-parmer
Milli-Q Plus Ultrapure Water System	Millipore	ZD5211584
Ophthalmic monofilament nylon suture	Ethicon	9007G
Photometry and Dimensioning Microscope	Motic	AE31
Pressure Servo Controller with peristaltic pump and pressure transducer	Living Systems Instrumentation	PS-200
Stereomicroscope	Nikon Instruments Inc	SMZ660
Vessel Chamber	Living Systems Instrumentation	CH-1
Dissection dish	Living Systems Instrumentation	DD-90-S
Thin Wall Glass Capillaries	World Precision Instruments	TW120-6
Microforge	Stoelting	51550
			Table 3.