Monitoraggio dei cambiamenti di polarità membrana, membrana integrità e intracellulare di ioni concentrazioni in<em> Streptococcus pneumoniae</em> Utilizzo di tinture fluorescenti

Summary

A differenza di quanto osservato per eucarioti, c'è una scarsità di studi che dettaglio depolarizzazione della membrana e concentrazione di ioni cambiamenti nei batteri, principalmente come loro piccole dimensioni lo metodi convenzionali di misura difficile. Qui, i protocolli di dettaglio per il monitoraggio di tali eventi nel significativa Gram-positivi patogeno Streptococcus pneumoniae utilizzando tecniche di fluorescenza.

Abstract

Depolarizzazione della membrana e flussi ionici sono eventi che sono stati studiati ampiamente nei sistemi biologici a causa della loro capacità di influire profondamente funzioni cellulari, tra cui l'energetica e trasduzione del segnale. Mentre entrambi i metodi fluorescenti ed elettrofisiologici, incluso l'impiego dell'elettrodo e patch-bloccaggio, sono stati ben sviluppati per misurare questi eventi in cellule eucariotiche, una metodologia per misurare eventi simili a microrganismi hanno dimostrato più impegnativo per sviluppare in loro piccole dimensioni in combinazione con il più complesso superficie esterna dei batteri schermanti membrana. Durante i nostri studi di morte-iniziazione Streptococcus pneumoniae (pneumococco), abbiamo voluto chiarire il ruolo degli eventi di membrana, compresi i cambiamenti di polarità, l'integrità e la concentrazione di ioni intracellulari. Ricerca della letteratura, abbiamo scoperto che esistono pochissimi studi. Altri ricercatori hanno monitorato radioisotopo captazione o di equilibrio per misurare l'influenza di ionixes e potenziale di membrana e un numero limitato di studi, soprattutto negli organismi Gram-negativi, avevano visto un certo successo con carbocyanine o oxonol coloranti fluorescenti per misurare il potenziale di membrana, oppure caricare i batteri con acetossimetilico cellula-permeabile (AM) versioni estere di ione-sensibile coloranti indicatori fluorescenti. Abbiamo quindi stabilito e ottimizzato i protocolli per la misura del potenziale di membrana, la rottura, e ionico trasporto nell'organismo Gram-positivi S. pneumoniae. Abbiamo sviluppato protocolli usando il colorante bis-oxonol DiBAC ₄ (3) e il colorante propidio ioduro cellula-impermeant per misurare depolarizzazione della membrana e la rottura, rispettivamente, così come i metodi per caricare in modo ottimale la pneumococchi con gli esteri AM dei coloranti raziometrici Fura-2, PBFI, e BCECF per rilevare cambiamenti nella concentrazione intracellulare di Ca ^{2 +,} K ^+, H ⁺ e, rispettivamente, utilizzando un lettore di piastre a fluorescenza di rilevamento. Questi protocolli sono i primi nel loro genere per il pneumococcoe la maggioranza di questi coloranti non sono stati utilizzati in altre specie batteriche. Anche se sono stati ottimizzati i nostri protocolli per S. pneumoniae, crediamo che questi approcci dovrebbero costituire un ottimo punto di partenza per studi simili in altre specie batteriche.

Introduction

Il nostro laboratorio ha identificato un complesso proteico-lipidico del latte umano di nome HAMLET (for Human Alpha-lattoalbumina Fatto letale per le cellule tumorali) che induce apoptosi nelle cellule tumore, ma è anche in grado di uccidere una grande varietà di specie batteriche ^1,2. Le specie che sono stati trovati per essere particolarmente sensibile erano quelli che colpiscono le vie respiratorie, con Streptococcus pneumoniae (pneumococco) visualizzando la massima sensibilità e un fenotipo simile all'apoptosi di morte ^2,3. Depolarizzazione della membrana e di ioni specifici eventi di trasporto sono ben descritti e eventi cruciali durante l'apoptosi nelle cellule eucariotiche, particolari nei mitocondri, dove sono stati utilizzati radioattive ⁺ ioni TPP e coloranti fluorescenti, tra cui JC-1 e TMRE per dimostrare depolarizzazione della membrana mitocondriale ^{3 -5.} Così, abbiamo cercato di saperne di più circa l'effetto di HAMLET su queste caratteristiche di membrana correlate in pneumococco, come abbiamo concentrato i nostri sforzi persviluppare una migliore comprensione dei componenti meccanicistiche del fenotipo simile all'apoptosi nei batteri, con un grande potenziale per identificare terapie antibatteriche o di nuovi vaccini candidati nel processo.

Nel cercare di stabilire protocolli per i nostri studi meccanicistici, abbiamo scoperto che, contrariamente alla metodologia ben descritto in sistemi eucariotici, ci sono pochi studi pubblicati che descrivono elettrofisiologia e meccanismi di trasporto ionico della membrana batterica ^6,7. Questo è principalmente attribuito alla dimensione più piccola di microrganismi e la loro architettura superficie, in particolare la presenza di parete cellulare, che limita l'accessibilità della membrana per uso di metodi convenzionali come eucariotiche Patch di serraggio, anche se alcuni studi con protoplasti giganti sono stati eseguiti con successo mista ^8,9. Come lavoro con questi protoplasti giganti non è un metodo ideale o anche pratico per la maggior parte delle specie batteriche poiché richiede uomobatteri ipulated in uno stato innaturale e abiotico, gli studi limitati di membrana batterica polarità che sono stati eseguiti hanno principalmente impiegato citofluorimetria e l'uso di coloranti fluorescenti cianina e oxonol ^10-16.

Invece di citometria a flusso, che raccoglie le letture della fluorescenza singoli da un batterio ad un unico punto di tempo, abbiamo scelto di utilizzare un lettore di piastra di rilevamento di fluorescenza per rilevare l'intensità di fluorescenza delle sospensioni batteriche in un formato a 96 pozzetti nel tempo. Questo ci ha consentito di trattare una popolazione di batteri in vari momenti con maggiore semplicità e facilità, e monitorare la cinetica di fluorescenza di tutta la popolazione per lunghi periodi di tempo, che è difficile da ottenere in citometria a flusso. Dopo aver testato una grande varietà di coloranti fluorescenti potenziali sensibili (fra cui quelli citati per l'uso con i mitocondri), abbiamo ottenuto il miglior successo tecnico e pratico usando l'bis-oxonol colorante chiamato DiBAC ₄ (3) (bis-(acido 1,3-dibutylbarbituric) trimethine oxonol) per monitorare i cambiamenti di polarità.

Abbiamo anche trovato prezioso per monitorare contemporaneamente interruzioni nella integrità della membrana con ioduro di propidio (PI). Questo colorante fluorescente in seguito al legame di acido nucleico, ma è solo in grado di fare in modo che quando l'integrità della membrana batterica è compromessa, il che rende il componente popolare utilizzato per rilevare le cellule morte in saggi di colorazione vivi-morti. Oltre a PI, Sytox verde e TO-PRO-1 sono coloranti fluorescenti che sono simili in azione e sono stati precedentemente utilizzati per i batteri in pochi studi in citometria a flusso metodi di rilevamento ^17. Abbiamo scelto di usare PI a causa della sua lunghezza d'onda di eccitazione che ci ha permesso di monitorare la propria fluorescenza in concomitanza con DiBAC in un dato campione.

Nei nostri studi, abbiamo osservato che AMLETO, così come un altro complesso proteina-lipide correlata con attività battericidanoto come Eloa, depolarizzazione indotta e rottura della membrana batterica come indicato dall'aumento nel fluorescenza di entrambi i coloranti in seguito al trattamento del pneumococchi ^3,18,26. Per entrambi i complessi, abbiamo osservato che l'intensità di fluorescenza di DiBAC ₄ (3) aumentata prima dell 'aumento di intensità di PI, indicando che depolarizzazione verificato prima della rottura ed è, quindi, un evento specifico indotta dai nostri complessi proteina-lipide battericida dei interesse. Questa distinzione è importante fare, come rottura della membrana stessa può causare depolarizzazione aspecifica. Cinetica misurare ed analizzare sia DiBAC ₄ (3) e PI fluorescenza contemporaneamente ci ha permesso di esaminare questo rapporto tra i due eventi membrana, che è un ulteriore vantaggio di utilizzare fluorometria invece di citometria a flusso.

Per monitorare flusso di ioni batterica, c'è stato qualche successo precedente con l'utilizzo di radioisotopi misura incluso l'assorbimento di45 Ca ^{2 +} nel pneumococco ^19,20, che abbiamo usato anche nei nostri recenti studi ^{18, 21.} Tuttavia, lavorando con questi ioni radioattivi ha diversi svantaggi. Possono essere costoso, richiede tempo, e disordinato, e può anche esporre la persona che esegue l'esperimento a danneggiare, a seconda della isotopo di interesse. Inoltre, è difficile controllare rapidi cambiamenti nel tempo. Così, ci siamo rivolti verso un metodo alternativo di misura che utilizza le versioni acetossimetilico (AM) estere di indicatore fluorescente coloranti ionici sensibili. Di per sé, il colorante indicatore è carico e non passa attraverso la membrana facilmente, ma con l'aggiunta del gruppo estere lipofilo, la molecola ora uncharged può passare attraverso la membrana del batterio. Entrando interni, i esterasi batteriche fendere il gruppo estere lasciando colorante libero all'interno della cellula e di nuovo caricato, rallentando significativamente la sua capacità per uscire dalla cella e consentendo il colorante to accumularsi all'interno nel tempo. Tuttavia, l'uso di questi coloranti estere è stata descritta solo in alcune specie batteriche per rilevare variazioni di ^{Ca2 +} intracellulare ^22-24 e H ^{+ 16,} con diversi metodi di carico, rilevamento, e il successo.

Con il desiderio di monitorare i cambiamenti in intracellulare di Ca ^{2 +} e anche i livelli di K ⁺ e H ⁺ in S. pneumoniae in seguito al trattamento con Amleto e altri composti, abbiamo creato con successo i protocolli di caricare in modo efficiente coloranti indicatori fluorescenti in cellule batteriche. Loading efficace nei batteri necessari sia probenecid che aumenta la ritenzione di colorante bloccando anioni-trasportatori e PowerLoad, un composto brevettato da Life Technologies che aumenta l'efficienza di carico. Fura-2/AM (rilevazione Ca ^{2 +),} PBFI / AM (rilevamento K ^+), e BCECF / AM (rilevamento H ⁺⁾ sono stati caricati con successo in entrambi unencapsulated e incapsulato pneumococco stpiogge che consentono la misurazione delle risultanti pattern di fluorescenza dopo l'aggiunta di ionofori, come ionomicina (Ca ^{2 +} disaccoppiatore), valinomicina (K ⁺ disaccoppiatore) e CCCP (H ⁺ disaccoppiatore) utilizzando un lettore di piastra di rilevamento di fluorescenza ^{18, 21.}

Protocol

1. Preparazione di colture batteriche Crescente cultura per l'uso negli esperimenti In un blocco di riscaldamento a 37 ° C, scongelare un gelato di stock fiala di S. pneumoniae e aggiungere il contenuto di 9 ml di fresco, preriscaldata Todd-Hewitt brodo con estratto di lievito 0,5% (THY) per un volume totale di 10 ml in una provetta di coltura di vetro. Incubare staticamente a 37 ° C fino a che la coltura raggiunga fase mid-log (Abs 600nm ≈ 0.5-0…

Representative Results

Per tutti gli esperimenti, c'è un campione e insieme di condizioni presenti in ciascun pozzetto. Così, ogni tracciato rappresenta l'intensità di fluorescenza di un'intera popolazione di batteri nel tempo. I risultati dovrebbero essere facilmente interpretabile, con una netta distinzione tra la fluorescenza dei campioni trattati e quella dei controlli non trattati. La cinetica e gradi di un cambiamento osservato in fluorescenza potrebbero fornire informazioni sul possibile meccanismo e la portata …

Discussion

Nonostante la limitazione che presenta dimensioni per elettrofisiologia con metodi classici per rilevare variazioni di polarità e l'integrità della membrana e variazioni nelle concentrazioni di ioni all'interno batteri, abbiamo descritto un modo per misurare questi eventi in S. pneumoniae utilizzando coloranti fluorescenti. I nostri protocolli sono i primi nel loro genere descritto per il pneumococco e uno dei pochi descritto per specie batteriche in generale. Utilizzando un lettore di piastra di rile…

Materials

Todd Hewitt	Bacto, BD Diagnostics	249240
Yeast Extract	Bacto, BD Diagnostics	212750
Phosphate Buffered Saline (PBS; pH 7.2)	Invitrogen (GIBCO)
Dimethyl sulfoxide	Sigma-Aldrich	D5879	DMSO
DiBAC4(3) (bis-(1,3-dibutylbarbituric acid) trimethine oxonol)	Molecular Probes	B-438
Propidium Iodide	Sigma-Aldrich	P4170	Make up in deionized water
D-(+)-Glucose	Sigma-Aldrich
PowerLoad	Molecular Probes	P10020	100X concentrate
Probenecid	Molecular Probes	P36400	Make 100X stock by adding 1 ml of PBS to one 77 mg vial
Fura-2/AM	Molecular Probes	F1221	Special packaging (50 µg aliquots)
PBFI/AM	Molecular Probes	P1267	Special packaging (50 µg aliquots)
Nigericin	Sigma-Aldrich	N7143
KH2PO4	JT Baker	3246-01	monobasic
K2HPO4	JT Baker	4012-01	dibasic
NaOH	JT Baker	5565-01
BCECF/AM	Molecular Probes	B1170	Special packaging (50 µg aliquots)
CCCP	Sigma-Aldrich		Protonophore that causes an influx of H+ into the cytoplasm,
			dissipating the electrical potential and the H+ gradient.
Culture tube	VWR	53283-802	Fits the Spectronic spectrophotometer; borosilicate glass
Spectrophotometer	Thermo Scientific		Spectronic 20D+
15 ml plastic conical tube	Corning	430790
Clear 96-well polystyrene microtiter plate	Fisher Scientific	12-565-501
Plate reader	BioTek	Synergy 2 Multi-Mode
		Microplate Reader
Gen5 software	BioTek	Gen5™ Software