على المدى الطويل المزمن<em> الزائفة الزنجارية</em> عدوى مجرى الهواء في الفئران
Summary
نحن تصف طريقة أجار حبات لإقامة عدوى مجرى الهواء المستمر على المدى الطويل المزمن الزائفة الزنجارية في نموذج الفأر.
Abstract
نموذج الفأر من عدوى المسالك الهوائية المزمن هو أحد الأصول الرئيسية في التليف الكيسي (CF) البحوث، وعلى الرغم من أن هناك عدد من المخاوف بشأن النموذج نفسه. المراحل المبكرة من الالتهاب والعدوى وقد تم دراسة على نطاق واسع باستخدام الزائفة الزنجارية نموذج أجار الخرز الماوس، في حين ركزت تقارير قليلة فقط على العدوى المزمنة على المدى الطويل في الجسم الحي. يبقى التحدي الرئيسي لعدوى مزمنة على المدى الطويل عبء البكتيرية منخفضة من قبل P. الزنجارية ونسبة منخفضة من الفئران المصابة أسابيع بعد التحدي، مشيرا إلى أن الخلايا البكتيرية يتم مسح تدريجيا من قبل المضيف.
تعرض هذه الورقة طريقة للحصول على كفاءة عدوى مزمنة طويلة الأجل في الفئران. ويستند هذا الأسلوب على التضمين من P. الزنجارية سلالات السريرية في حبات أجار في المختبر، تليها التقطير داخل القصبة الهوائية في الفئران C57Bl/6NCrl. ويرتبط التهاب في الرئتين الثنائية مع بغازياألطراف قابلة للقياس للقراءة عموميات بما في ذلك فقدان الوزن، وفيات، والعدوى المزمنة، والاستجابة للالتهابات. وP. كان يفضل الزنجارية RP73 سلالة السريرية على مدى سلالة المختبر المرجعي PAO1 لأنه أدى إلى وفيات أقل نسبيا، أشد الآفات، والعدوى المزمنة أعلى. P. قد تستمر الزنجارية الاستعمار في الرئة لأكثر من ثلاثة أشهر. الفئران أمراض الرئة يشبه ذلك من مرضى التليف الكيسي يعانون من أمراض رئوية مزمنة متقدمة.
هذا نموذج الفئران يحاكي معظم كثب مسار المرض الإنسان، ويمكن استخدامها على حد سواء لدراسات عن المرضية وتقييم علاجات جديدة.
Introduction
التليف الكيسي (CF) هو مرض وراثي التي تسببها طفرات في التليف الكيسي عبر الغشاء تصرف منظم (CFTR) الجينات. هذا الجين يشفر لقناة كلوريد أعرب على الغشاء معظم الخلايا الظهارية. تسبب توسع القصبات، يسد المخاط ومتني الدمار أساسا من التهابات الزائفة الزنجارية يؤدي تدريجيا إلى أمراض الرئة الحادة والوفيات في معظم المرضى CF 1. فهم المرضية CF ومزيد من علاجات جديدة تعتمد على تطوير نموذج حيواني مع السمات المميزة لCF. العديد من الفئران، المعدلة وراثيا لهذا الجين CFTR، تم إنشاؤه لكن القيود في قدرة تلك الأنواع ألخص بأمراض الرئة CF-مثل وعدة تشوهات الجهاز التي شوهدت في مرضى التليف الكيسي قد تم توثيقها على نطاق واسع 2.
تطوير عدوى هي واحدة من التحديات الرئيسية في نموذج حيواني CF. على البنود الأدبيقترح في وقت مبكر أن عدوى مزمنة دائم أكثر من شهر واحد يمكن أن يتحقق إلا إذا تم تلقيح الفئران مع البكتيريا جزءا لا يتجزأ من وكيل شل حركة مثل أجار، الاغاروز، أو الأعشاب البحرية الجينات 3-5. توفر هذه العوامل شل حركة الشروط microaerobic / اللاهوائية التي تسمح للبكتيريا أن تنمو في شكل microcolonies، على غرار النمو في المخاط من المرضى CF 6. هذا النموذج من عدوى مزمنة تؤدي إلى استمرار البكتيريا في الرئتين تسبب التهاب الشعب الهوائية والأضرار 7. ومع ذلك، اعتمادا على الطريقة المستخدمة، السلالة البكتيرية وجرعة تلقيح في الرئتين، فإن النسبة المئوية من الفئران المصابة المزمن والحمل البكتيري تعافى في الرئتين عند نقاط زمنية مختلفة يمكن أن تختلف إلى حد كبير. على وجه الخصوص، لا يزال التحدي الرئيسي للعدوى مزمنة طويلة الأجل عبء البكتيرية منخفضة من قبل P. الزنجارية ونسبة منخفضة من الفئران المصابة أسابيع بعد التحدي، مشيرا ثايتم مسح الخلايا البكتيرية ر تدريجي من قبل المضيف. عن طريق تحديد P. الزنجارية RP73 سلالة السريرية من مجموعة من CF يعزل 8 حصلنا عليها بنجاح وفيات منخفض، والآفات أكثر حدة، ونسبة عالية من العدوى المزمنة مع الحمولة الجرثومية مستقرة تصل إلى شهر واحد في الفئران C57Bl/6NCrl.
تفاصيل هذه الورقة منهجية لتضمين P. الزنجارية في حبات أجار، ولدينا إصابة الفئران عن طريق التقطير داخل القصبة الهوائية، ويقاس الحمل والسيتوكينات البكتيرية في الرئتين، وجمع السائل BAL وأجرى الفحص النسيجي. عموما، فإن هذا البروتوكول مساعدة الباحثين في معالجة المسائل الهامة أساسا على 8،9 المرضية واختبار علاجات جديدة ضد P. الزنجارية عدوى مزمنة 10،11.
Protocol
Representative Results
Discussion
الخطوات الحاسمة في P. وذكرت الزنجارية حبات إعداد والتحدي الماوس أدناه.
سلالة الزنجارية P. المستخدمة للفئران التحدي أمر بالغ الأهمية. الوفيات، عدوى مزمنة أو التخليص ربما تختلف اختلافا كبيرا تبعا لإجهاد البكتيريا تس?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد تم تمويل البحوث في مختبر Bragonzi من قبل مؤسسة الإيطالية التليف الكيسي (CFaCore) والاتحاد الأوروبي وF7-2009-223670. تم تنفيذ جزء من هذا العمل في الإنبيق، مختبر المجهر المتقدمة، وأجري التشريح المرضي الماوس في وحدة من تشريح المرضي (معهد سان رافاييل العلمي).
Materials
| Bacto Tryptic Soy Broth | Becton Dickinson | 211823 | |
| Difco Agar, granulated | Becton Dickinson | 214510 | |
| Heavy mineral oil | Sigma-Aldrich | 330760-1L | |
| S-(+)-Ketamine hydrochloride | Sigma-Aldrich | K1884 | |
| Xylazine hydrochloride | Sigma-Aldrich | X1251 | |
| 1 ml syringe 25 G 5/8'' 0.5 x 16 mm | PIC | 3071250300350 | |
| Catheter 22GA 0.9 x 25 mm | Becton Dickinson | 381223 | |
| Graefe Forceps – 0.5 mm Tips Curved | Fine Science Tools | 11152-10 | |
| Scissors, Iris, 11 cm, straight | World Precision Instruments | 501758 | |
| Suture clips | Fine Science Tools | 12040-01 | |
| Suture thread | Fine Science Tools | 18020-40 | |
| RPMI 1640 | Lonza | BE12-167F | |
| Complete protease inhibitor cocktail | Roche | 11836145001 | |
| Fast-Read 102 Burker disposable chamber | Biosigma | 390497 | |
| Tuerk solution | Fluka | 93770 | |
| RBC lysis buffer | Biolegend | 420301 | |
| Fetal bovine serum | Lonza | DE14-801F | |
| EZ cytofunnel | Thermo Scientific | A78710021 | |
| Superfrost ultra plus microscope slides | Thermo Scientific | J3800AMNZ | |
| Diff-Quik Romanowsky staining set | Medion Diagnostics | 130832 | |
| Hexadecyltrimethylammonium chloride | Sigma-Aldrich | 52366-10G | |
| 96-well EIA/RIA plate | Costar | 3590 | |
| 3,3’,5,5’- tetramethylbenzidine | Sigma-Aldrich | T8665-1L | |
| Sulfuric acid | Sigma-Aldrich | 320501-1L | |
| 10% neutral buffered formalin | Bio-optica | 05-01005Q | |
| Harris haematoxylin non Papanicolau | Bio-optica | 05-M06004 | |
| Eosin plus alcoholic solution | Bio-optica | 05-M11007 | |
| [header] | |||
| Equipment | |||
| Shaking incubator | Amerex Instruments | Steady Shake 757 | |
| Water bath | Grant | SUB14 | |
| Homogenizer | Ystral | ||
| Precision balance | KERN | 440-47N | |
| Cytocentrifuge | Thermo Scientific | A78300003 | |
| Low Cost Heating Pad | 2biol | LCHP | |
| Homogenization probe | Ystral | 2366931(great) | |
| 2366925(small) | |||
| Inverted optical microscope | Zeiss | Axioplan2 | |
| Camera (microscope) | Zeiss | Axiocam MRc5 | |
| Rotary microtome | Leica | RM2255 |
References
- Gibson, R., Burns, J. L., Ramsey, B. W. Pathophysiology and management of pulmonary infections in cystic fibrosis. Am. J. Respir. Crit. Care. 168, 918-951 (2003).
- Bragonzi, A. Murine models of acute and chronic lung infection with cystic fibrosis pathogens. IJMM. 300, 584-593 (2010).
- Cash, H. A., McCullough, B., Johanson, W. G., Bass, J. A. A rat model of chronic respiratory infection with Pseudomonas aeruginosa. Am. Rev. Respir. Dis. 119, 453-459 (1979).
- Starke, J. R., Langston, C., Baker, C. J. A mouse model of chronic pulmonary infection with Pseudomonas aeruginosa and Pseudomonas cepacia. Pediatr. Res. 22, 698-702 (1987).
- Pedersen, S. S., Hansen, B. L., Hansen, G. N. Induction of experimental chronic Pseudomonas aeruginosa lung infection with P. aeruginosa entrapped in alginate microspheres. APMIS. 98, 203-211 (1990).
- Bragonzi, A., et al. Nonmucoid Pseudomonas aeruginosa expresses alginate in the lungs of patients with cystic fibrosis and in a mouse model. J. Infect. Dis. 192, 410-419 (2005).
- van Heeckeren, A. M. Murine models of chronic Pseudomonas aeruginosa lung infection. Lab. Anim. 36, 291-312 (2002).
- Bragonzi, A., et al. Pseudomonas aeruginosa microevolution during cystic fibrosis lung infection establishes clones with adapted virulence AJRCCM. 180, 138-145 (2009).
- Kukavica-Ibrulj, I., Facchini, M., Cigana, C., Levesque, R. C., Bragonzi, A., Filloux, S., Ramos, J. L. Assessing Pseudomonas aeruginosa virulence and the host response using murine models of acute and chronic lung infection. Methods in Pseudomonas aeruginosa: Humana Press. , (2014).
- Moalli, F., et al. The Therapeutic Potential of the Humoral Pattern Recognition Molecule PTX3 in Chronic Lung Infection Caused by Pseudomonas aeruginosa. J. Immunol. 186, 5425-5534 .
- Paroni, M. Response of CFTR-deficient mice to long-term Pseudomonas aeruginosa chronic infection and PTX3 therapeutic treatment. J. Infect. Dis. In press, .
- Maxeiner, J., Karwot, R., Hausding, M., Sauer, K. A., Scholtes, P., Finotto, S. A method to enable the investigation of murine bronchial immune cells, their cytokines and mediators. Nat. Protoc. 2, 105-112 (2007).
- Bragonzi, A., et al. Pseudomonas aeruginosa microevolution during cystic fibrosis lung infection establishes clones with adapted virulence.. AJRCCM. In press, (2009).
- Pirone, L., et al. Burkholderia cenocepacia strains isolated from cystic fibrosis patients are apparently more invasive and more virulent than rhizosphere strains. Environ. Microbiol. 10, 2773-2784 (2008).
- Bragonzi, A., et al. Modelling co-infection of the cystic fibrosis lung by Pseudomonas aeruginosa and Burkholderia cenocepacia reveals influences on biofilm formation and host response. PLoS One. 7, .
- Bianconi, I., et al. Positive signature-tagged mutagenesis in Pseudomonas aeruginosa: tracking patho-adaptive mutations promoting long-term airways chronic infection. PLoS Pathog.. 7, (2011).
