Uzun Vadeli Kronik<em> Pseudomonas aeruginosa</emFarelerde> Havayolu Enfeksiyon
Summary
Bu fare modelinde kalıcı, uzun vadeli kronik Pseudomonas aeruginosa enfeksiyonu kurmak için agar-boncuklar bir yöntem tarif eder.
Abstract
Modelin kendisi ile ilgili endişeleri bir dizi olmasına rağmen, kronik solunum yolu enfeksiyonu fare modeli, kistik fibrozis (CF) araştırma önemli bir varlıktır. Yalnızca çok az sayıda rapor in vivo olarak uzun vadeli kronik enfeksiyon odaklı iken inflamasyon ve enfeksiyonun erken aşamaları yaygın olarak Pseudomonas aeruginosa agar-boncuk fare modeli kullanarak çalışılmıştır. Uzun süreli kronik enfeksiyon için temel zorluk P. tarafından düşük bakteriyel yük olmaya devam aeruginosa ve bakteri hücreleri giderek ev sahibi tarafından temizlenir belirten mücadeleden sonra enfekte olmuş fareler hafta düşük yüzdesi.
Bu çalışma, farede etkili, uzun vadeli kronik enfeksiyon elde etmek için bir yöntem sunmaktadır. Bu yöntem, P. katıştırma dayanır C57Bl/6NCrl farelerde trakea içi damlatma ardından in vitro agar-tanelerinde aeruginosa klinik suşları. Bilateral akciğer enfeksiyonu sev ile ilişkilikilo kaybı, ölüm, kronik enfeksiyon ve inflamatuar yanıt dahil eral ölçülebilir okuma-çıkışları. P. Bu nispeten daha düşük mortalite, daha ağır lezyonlar, ve daha yüksek kronik enfeksiyona neden beri aeruginosa RP73 klinik suşu PAO1 referans laboratuvar suşu tercih edildi. P. aeruginosa kolonizasyonu üç aydan fazla akciğer devam edebilir. Murin akciğer patolojisi ilerlemiş kronik akciğer hastalığı olan hastalarda CF benzediği.
Bu fare modeli en yakın insan hastalığın seyrini taklit eden ve patojenez çalışmalarında ve yeni tedavilerin değerlendirilmesi için de kullanılabilir.
Introduction
Kistik fibrozis (CF) kistik fibrozis transmembran iletkenlik regülatör (CFTR) gen mutasyonlarının neden olduğu genetik bir hastalıktır. Bu gen, en epitel hücrelerinin membranı üzerinde ifade edilen bir klorür kanal için kodlar. Bronşektazi, mukus tıkacı ve parankimal yıkım giderek ciddi akciğer hastalığı ve CF hastaların 1 çoğunda mortaliteye neden Pseudomonas aeruginosa enfeksiyonlar çoğunlukla neden oldu. Anlama CF patogenez ve yeni tedavilerin daha da geliştirilmesi CF karakteristik özellikleri ile hayvan modelinde güveniyor. Genetik CFTR geni değiştirilmiş çeşitli fareler, üretildi, ancak CF gibi akciğer hastalığı ve KF hastalarında görülen birçok diğer organ anormallikleri özetlemek için bu türlerin yeteneği sınırlamalar yaygın olarak 2 belgelenmiştir.
Enfeksiyon gelişimi CF hayvan modelinde önemli sorunlardan biridir. Edebiyat clErken fareler, ağar, agaroz, alginat ya da yosun 3-5 gibi bir hareketsiz kılma maddesini içine gömülü bakteri ile aşılanır yalnızca bir aydan fazla süren bir kronik enfeksiyon elde edilebileceğini göstermektedir. Bu hareketsizleştirici maddeler, bakteriler Benzer CF hastalarında 6'nın mukus büyümesine, mikrokoloniler şeklinde büyümeye izin mikroaerobik / anaerobik şartları sağlar. Kronik enfeksiyon Bu model hava yolu enflamasyonu ve hasara neden 7 akciğerlerde bakterilerin sürekli olmasına yol açmaktadır. Ancak, kullanılan yöntem, bakteri suşu ve akciğer aşılandı dozuna bağlı olarak, farklı zaman noktalarında akciğerlerde geri kronik enfekte edilmiş farelerin yüzdesi ve bakteri yükü önemli ölçüde farklı olabilir. Özellikle, uzun süreli kronik enfeksiyon için ana zorluk P. tarafından düşük bakteriyel yük olmaya devam aeruginosa ve mücadeleden sonra enfekte olmuş fareler hafta düşük yüzdesi belirten that bakteri hücreleri giderek ev sahibi tarafından temizlenir. P. seçerek CF bir koleksiyon aeruginosa RP73 klinik suş başarıyla C57Bl/6NCrl farelerde bir ay için istikrarlı bir bakteri yüküne kadar düşük mortalite, daha ağır lezyonlar, ve kronik enfeksiyon yüksek oranda elde 8 ayırır.
Bu kağıt P. gömmek için metodoloji detayları Agar boncuk aeruginosa, biz, trakea içine aşılanmasıyla fareleri enfekte akciğerlerde bakteri yükü ve sitokinler ölçülen, BAL sıvısı toplanır ve histolojik muayene gerçekleştirdik. Genel olarak, bu protokol patogenez 8,9 tarihinde temelde önemli soruları ele P. karşı yeni tedaviler test araştırmacılarına yardımcı olacaktır aeruginosa kronik enfeksiyon 10,11.
Protocol
Representative Results
Discussion
P. kritik adımlar aeruginosa-boncuk hazırlama ve fare meydan aşağıda rapor edilmiştir.
Farenin meydan okuma için kullanılan P. aeruginosa ırk kritiktir. Mortalite, kronik enfeksiyon veya açıklık meydan okuma için kullanılan bakteri suşuna bağlı olarak önemli ölçüde farklılık gösterebilir. P. Bu nispeten daha düşük mortalite, daha ağır lezyonlar, ve daha yüksek kronik enfeksiyona neden beri aeruginosa RP73 klinik suşu…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bragonzi laboratuarında Araştırma İtalyan Kistik Fibrozis Vakfı (CFaCore) ve AB-F7-2009-223670 tarafından finanse edilmiştir. Bu çalışmanın bir parçası alembic, gelişmiş mikroskobu laboratuvarında gerçekleştirildi ve fare histopatoloji Patolojik Anatomi (San Raffaele Bilimsel Enstitüsü) Ünitesinde yapıldı.
Materials
| Bacto Tryptic Soy Broth | Becton Dickinson | 211823 | |
| Difco Agar, granulated | Becton Dickinson | 214510 | |
| Heavy mineral oil | Sigma-Aldrich | 330760-1L | |
| S-(+)-Ketamine hydrochloride | Sigma-Aldrich | K1884 | |
| Xylazine hydrochloride | Sigma-Aldrich | X1251 | |
| 1 ml syringe 25 G 5/8'' 0.5 x 16 mm | PIC | 3071250300350 | |
| Catheter 22GA 0.9 x 25 mm | Becton Dickinson | 381223 | |
| Graefe Forceps – 0.5 mm Tips Curved | Fine Science Tools | 11152-10 | |
| Scissors, Iris, 11 cm, straight | World Precision Instruments | 501758 | |
| Suture clips | Fine Science Tools | 12040-01 | |
| Suture thread | Fine Science Tools | 18020-40 | |
| RPMI 1640 | Lonza | BE12-167F | |
| Complete protease inhibitor cocktail | Roche | 11836145001 | |
| Fast-Read 102 Burker disposable chamber | Biosigma | 390497 | |
| Tuerk solution | Fluka | 93770 | |
| RBC lysis buffer | Biolegend | 420301 | |
| Fetal bovine serum | Lonza | DE14-801F | |
| EZ cytofunnel | Thermo Scientific | A78710021 | |
| Superfrost ultra plus microscope slides | Thermo Scientific | J3800AMNZ | |
| Diff-Quik Romanowsky staining set | Medion Diagnostics | 130832 | |
| Hexadecyltrimethylammonium chloride | Sigma-Aldrich | 52366-10G | |
| 96-well EIA/RIA plate | Costar | 3590 | |
| 3,3’,5,5’- tetramethylbenzidine | Sigma-Aldrich | T8665-1L | |
| Sulfuric acid | Sigma-Aldrich | 320501-1L | |
| 10% neutral buffered formalin | Bio-optica | 05-01005Q | |
| Harris haematoxylin non Papanicolau | Bio-optica | 05-M06004 | |
| Eosin plus alcoholic solution | Bio-optica | 05-M11007 | |
| [header] | |||
| Equipment | |||
| Shaking incubator | Amerex Instruments | Steady Shake 757 | |
| Water bath | Grant | SUB14 | |
| Homogenizer | Ystral | ||
| Precision balance | KERN | 440-47N | |
| Cytocentrifuge | Thermo Scientific | A78300003 | |
| Low Cost Heating Pad | 2biol | LCHP | |
| Homogenization probe | Ystral | 2366931(great) | |
| 2366925(small) | |||
| Inverted optical microscope | Zeiss | Axioplan2 | |
| Camera (microscope) | Zeiss | Axiocam MRc5 | |
| Rotary microtome | Leica | RM2255 |
References
- Gibson, R., Burns, J. L., Ramsey, B. W. Pathophysiology and management of pulmonary infections in cystic fibrosis. Am. J. Respir. Crit. Care. 168, 918-951 (2003).
- Bragonzi, A. Murine models of acute and chronic lung infection with cystic fibrosis pathogens. IJMM. 300, 584-593 (2010).
- Cash, H. A., McCullough, B., Johanson, W. G., Bass, J. A. A rat model of chronic respiratory infection with Pseudomonas aeruginosa. Am. Rev. Respir. Dis. 119, 453-459 (1979).
- Starke, J. R., Langston, C., Baker, C. J. A mouse model of chronic pulmonary infection with Pseudomonas aeruginosa and Pseudomonas cepacia. Pediatr. Res. 22, 698-702 (1987).
- Pedersen, S. S., Hansen, B. L., Hansen, G. N. Induction of experimental chronic Pseudomonas aeruginosa lung infection with P. aeruginosa entrapped in alginate microspheres. APMIS. 98, 203-211 (1990).
- Bragonzi, A., et al. Nonmucoid Pseudomonas aeruginosa expresses alginate in the lungs of patients with cystic fibrosis and in a mouse model. J. Infect. Dis. 192, 410-419 (2005).
- van Heeckeren, A. M. Murine models of chronic Pseudomonas aeruginosa lung infection. Lab. Anim. 36, 291-312 (2002).
- Bragonzi, A., et al. Pseudomonas aeruginosa microevolution during cystic fibrosis lung infection establishes clones with adapted virulence AJRCCM. 180, 138-145 (2009).
- Kukavica-Ibrulj, I., Facchini, M., Cigana, C., Levesque, R. C., Bragonzi, A., Filloux, S., Ramos, J. L. Assessing Pseudomonas aeruginosa virulence and the host response using murine models of acute and chronic lung infection. Methods in Pseudomonas aeruginosa: Humana Press. , (2014).
- Moalli, F., et al. The Therapeutic Potential of the Humoral Pattern Recognition Molecule PTX3 in Chronic Lung Infection Caused by Pseudomonas aeruginosa. J. Immunol. 186, 5425-5534 .
- Paroni, M. Response of CFTR-deficient mice to long-term Pseudomonas aeruginosa chronic infection and PTX3 therapeutic treatment. J. Infect. Dis. In press, .
- Maxeiner, J., Karwot, R., Hausding, M., Sauer, K. A., Scholtes, P., Finotto, S. A method to enable the investigation of murine bronchial immune cells, their cytokines and mediators. Nat. Protoc. 2, 105-112 (2007).
- Bragonzi, A., et al. Pseudomonas aeruginosa microevolution during cystic fibrosis lung infection establishes clones with adapted virulence.. AJRCCM. In press, (2009).
- Pirone, L., et al. Burkholderia cenocepacia strains isolated from cystic fibrosis patients are apparently more invasive and more virulent than rhizosphere strains. Environ. Microbiol. 10, 2773-2784 (2008).
- Bragonzi, A., et al. Modelling co-infection of the cystic fibrosis lung by Pseudomonas aeruginosa and Burkholderia cenocepacia reveals influences on biofilm formation and host response. PLoS One. 7, .
- Bianconi, I., et al. Positive signature-tagged mutagenesis in Pseudomonas aeruginosa: tracking patho-adaptive mutations promoting long-term airways chronic infection. PLoS Pathog.. 7, (2011).
