लंबी अवधि पुरानी<em> Pseudomonas aeruginosa</emचूहे में> श्वासनली संक्रमण
Summary
हम माउस मॉडल में लगातार लंबे समय तक पुरानी Pseudomonas aeruginosa airway संक्रमण की स्थापना के लिए अग्रवाल मोती विधि का वर्णन.
Abstract
मॉडल ही के बारे में चिंताओं के एक नंबर रहे हैं, हालांकि पुरानी airway संक्रमण के एक माउस मॉडल, सिस्टिक फाइब्रोसिस (CF) के अनुसंधान में एक महत्वपूर्ण परिसंपत्ति है. केवल कुछ रिपोर्टों विवो में लंबी अवधि के पुराने संक्रमण पर ध्यान केंद्रित किया है, जबकि सूजन और संक्रमण के प्रारंभिक चरणों में व्यापक रूप से, Pseudomonas aeruginosa अग्रवाल मोती माउस मॉडल का उपयोग करके अध्ययन किया गया है. लंबी अवधि के पुराने संक्रमण के लिए मुख्य चुनौती पी. से कम बैक्टीरियल बोझ रहता है aeruginosa और बैक्टीरियल कोशिकाओं उत्तरोत्तर मेजबान द्वारा मंजूरी दे दी है यह दर्शाता है कि चुनौती के बाद संक्रमित चूहों सप्ताह के कम प्रतिशत,.
इस पत्र चूहों में कुशल लंबे समय तक पुराने संक्रमण प्राप्त करने के लिए एक विधि प्रस्तुत करता है. इस विधि पी. के embedding पर आधारित है C57Bl/6NCrl चूहों में intratracheal टपकाना द्वारा पीछा विट्रो में अग्रवाल मोती में aeruginosa नैदानिक उपभेदों. द्विपक्षीय फेफड़ों के संक्रमण सेव साथ जुड़ा हुआ हैवजन घटाने, मृत्यु दर, पुराने संक्रमण, और भड़काऊ प्रतिक्रिया सहित आम मध्यम श्रेणी पढ़ें बहिष्कार. पी. यह एक अपेक्षाकृत कम मृत्यु दर, अधिक गंभीर घावों, और उच्च पुराने संक्रमण के परिणामस्वरूप के बाद से aeruginosa RP73 नैदानिक तनाव PAO1 संदर्भ प्रयोगशाला तनाव से अधिक पसंद किया गया था. पी. aeruginosa बसाना तीन महीने के लिए फेफड़ों में बना रह सकता है. Murine फेफड़ों विकृति उन्नत पुरानी फेफड़े के रोग के साथ सीएफ़ रोगियों की है कि जैसा दिखता है.
इस murine मॉडल सबसे निकट मानव रोग के पाठ्यक्रम mimics और रोगजनन पर अध्ययन के लिए और उपन्यास के उपचारों के मूल्यांकन के लिए दोनों इस्तेमाल किया जा सकता है.
Introduction
सिस्टिक फाइब्रोसिस (CF) सिस्टिक फाइब्रोसिस transmembrane प्रवाहकत्त्व नियामक (CFTR) जीन में उत्परिवर्तन के कारण एक आनुवांशिक बीमारी है. इस जीन सबसे उपकला कोशिकाओं की झिल्ली पर व्यक्त एक क्लोराइड चैनल के लिए encodes. श्वासनलिकाविस्फार, बलगम plugging और parenchymal विनाश उत्तरोत्तर गंभीर फेफड़ों के रोग और CF रोगियों 1 से ज्यादातर में मृत्यु दर को जन्म दे Pseudomonas aeruginosa संक्रमण के कारण मुख्य रूप से. समझौता सीएफ रोगजनन और उपन्यास के उपचारों के आगे विकास CF की विशेषता सुविधाओं के साथ पशु मॉडल पर भरोसा करते हैं. आनुवंशिक रूप CFTR जीन के लिए संशोधित कई चूहों,, उत्पन्न किया गया है, लेकिन CF-जैसे फेफड़ों के रोग और सीएफ रोगियों में देखा कई अन्य अंग असामान्यताएं पुनरावृत्ति करने के लिए इन प्रजातियों की क्षमता में सीमाओं को व्यापक रूप से 2 प्रलेखित किया गया है.
संक्रमण के विकास CF पशु मॉडल में प्रमुख चुनौतियों में से एक है. साहित्य सीएलजल्दी चूहों ऐसे अग्रवाल, agarose, या समुद्री शैवाल alginate 3-5 के रूप में एक immobilizing एजेंट में एम्बेडेड बैक्टीरिया के साथ inoculated तभी से अधिक एक महीने तक चलने वाले एक पुराने संक्रमण प्राप्त किया जा सकता है. ये immobilizing एजेंट बैक्टीरिया इसी सीएफ़ रोगियों 6 के बलगम में वृद्धि करने के लिए, microcolonies के रूप में विकसित करने की अनुमति है कि microaerobic / अवायवीय स्थितियों प्रदान करते हैं. पुराने संक्रमण का यह मॉडल airway सूजन और क्षति 7 के कारण फेफड़ों में बैक्टीरिया की दृढ़ता की ओर जाता है. हालांकि, प्रयोग विधि, बैक्टीरियल तनाव और फेफड़ों में टीका खुराक पर निर्भर करता है, अलग अलग समय बिंदुओं पर फेफड़ों में बरामद पुरानी संक्रमित चूहों का प्रतिशत और जीवाणु लोड काफी अलग कर सकते हैं. विशेष रूप से, लंबे समय तक पुराने संक्रमण के लिए मुख्य चुनौती पी. से कम बैक्टीरियल बोझ रहता है aeruginosa और चुनौती के बाद संक्रमित चूहों सप्ताह के कम प्रतिशत का संकेत थाटी बैक्टीरियल कोशिकाओं उत्तरोत्तर मेजबान द्वारा मंजूरी दे दी है. पी. चयन करके सीएफ के एक संग्रह से aeruginosa RP73 नैदानिक तनाव हम सफलतापूर्वक C57Bl/6NCrl चूहों में एक महीने के लिए एक स्थिर बैक्टीरियल लोड के साथ कम मृत्यु दर, अधिक गंभीर घावों, और पुराने संक्रमण के उच्च प्रतिशत प्राप्त 8 आइसोलेट्स.
इस पत्र पी. एम्बेड करने के लिए कार्यप्रणाली का विवरण अगर मोतियों में aeruginosa, हम, intratracheal टपकाना द्वारा संक्रमित चूहों के फेफड़ों में बैक्टीरियल लोड और साइटोकिन्स मापा, बाल तरल पदार्थ एकत्र और ऊतकीय परीक्षा प्रदर्शन किया है. कुल मिलाकर, इस प्रोटोकॉल रोगजनन 8,9 पर मूल रूप से महत्वपूर्ण सवालों को संबोधित करने और पी. के खिलाफ उपन्यास चिकित्सा परीक्षण में शोधकर्ताओं सहायता करेगा aeruginosa पुराने संक्रमण 10,11.
Protocol
Representative Results
Discussion
पी. में महत्वपूर्ण कदम aeruginosa मोती तैयारी और माउस चुनौती नीचे रिपोर्ट कर रहे हैं.
चूहों चुनौती के लिए इस्तेमाल पी. aeruginosa तनाव महत्वपूर्ण है. मृत्यु दर, पुराने संक्रमण या निकासी चुनौती क?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bragonzi प्रयोगशाला में रिसर्च इतालवी सिस्टिक फाइब्रोसिस फाउंडेशन (CFaCore) और यूरोपीय संघ के F7-2009-223670 द्वारा वित्त पोषित किया गया है. इस काम का हिस्सा एलेम्बिक, एक उन्नत माइक्रोस्कोपी प्रयोगशाला में किया गया, और माउस ऊतकविकृतिविज्ञानी रोग शरीर रचना विज्ञान (सैन Raffaele वैज्ञानिक संस्थान) की यूनिट में प्रदर्शन किया गया था.
Materials
| Bacto Tryptic Soy Broth | Becton Dickinson | 211823 | |
| Difco Agar, granulated | Becton Dickinson | 214510 | |
| Heavy mineral oil | Sigma-Aldrich | 330760-1L | |
| S-(+)-Ketamine hydrochloride | Sigma-Aldrich | K1884 | |
| Xylazine hydrochloride | Sigma-Aldrich | X1251 | |
| 1 ml syringe 25 G 5/8'' 0.5 x 16 mm | PIC | 3071250300350 | |
| Catheter 22GA 0.9 x 25 mm | Becton Dickinson | 381223 | |
| Graefe Forceps – 0.5 mm Tips Curved | Fine Science Tools | 11152-10 | |
| Scissors, Iris, 11 cm, straight | World Precision Instruments | 501758 | |
| Suture clips | Fine Science Tools | 12040-01 | |
| Suture thread | Fine Science Tools | 18020-40 | |
| RPMI 1640 | Lonza | BE12-167F | |
| Complete protease inhibitor cocktail | Roche | 11836145001 | |
| Fast-Read 102 Burker disposable chamber | Biosigma | 390497 | |
| Tuerk solution | Fluka | 93770 | |
| RBC lysis buffer | Biolegend | 420301 | |
| Fetal bovine serum | Lonza | DE14-801F | |
| EZ cytofunnel | Thermo Scientific | A78710021 | |
| Superfrost ultra plus microscope slides | Thermo Scientific | J3800AMNZ | |
| Diff-Quik Romanowsky staining set | Medion Diagnostics | 130832 | |
| Hexadecyltrimethylammonium chloride | Sigma-Aldrich | 52366-10G | |
| 96-well EIA/RIA plate | Costar | 3590 | |
| 3,3’,5,5’- tetramethylbenzidine | Sigma-Aldrich | T8665-1L | |
| Sulfuric acid | Sigma-Aldrich | 320501-1L | |
| 10% neutral buffered formalin | Bio-optica | 05-01005Q | |
| Harris haematoxylin non Papanicolau | Bio-optica | 05-M06004 | |
| Eosin plus alcoholic solution | Bio-optica | 05-M11007 | |
| [header] | |||
| Equipment | |||
| Shaking incubator | Amerex Instruments | Steady Shake 757 | |
| Water bath | Grant | SUB14 | |
| Homogenizer | Ystral | ||
| Precision balance | KERN | 440-47N | |
| Cytocentrifuge | Thermo Scientific | A78300003 | |
| Low Cost Heating Pad | 2biol | LCHP | |
| Homogenization probe | Ystral | 2366931(great) | |
| 2366925(small) | |||
| Inverted optical microscope | Zeiss | Axioplan2 | |
| Camera (microscope) | Zeiss | Axiocam MRc5 | |
| Rotary microtome | Leica | RM2255 |
References
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