Summary
Neuronale plasticiteit is een steeds meer erkend, maar onvoldoende duidelijk kenmerk van de gastro-intestinale (GI) stelsel. Hier, in het voorbeeld van menselijke pancreas aandoeningen presenteren we een in vitro assay neuroplasticiteit voor de studie van neuronale plasticiteit in het maagdarmkanaal, zowel morfologisch en functioneel niveau.
Abstract
Neuroplasticiteit is een inherent kenmerk van het enterische zenuwstelsel en gastro-intestinale (GI) innervatie onder pathologische omstandigheden. Echter, de pathofysiologische rol van neuroplasticiteit in GI-aandoeningen blijft onbekend. Nieuwe experimentele modellen die simulatie en modulatie van GI neuroplasticiteit toe kunnen verbeterde waardering voor de bijdrage van neuroplasticiteit in het bijzonder GI ziekten zoals pancreaskanker (PCA) en chronische pancreatitis (CP) in te schakelen. Hier presenteren we een protocol voor de simulatie van de pancreas neuroplasticiteit onder in vitro omstandigheden met behulp van pasgeboren ratten ganglia (DRG) en myenterische plexus (MP) neuronen. Deze dual-neuron aanpak het mogelijk om niet alleen de monitoring van zowel orgel-intrinsieke en extrinsieke-neuroplasticiteit, maar vertegenwoordigt ook een waardevol instrument om neuronale en gliale morfologie en elektrofysiologie beoordelen. Bovendien maakt de functionele modulatie van de meegeleverde micro-omgeving van de inhoud voor het bestuderen van hun IMPACt op neuroplasticiteit. Eenmaal vastgesteld, de onderhavige neuroplasticiteit test draagt de potentieel van toepassing op de studie van neuroplasticiteit in elk GI orgaan.
Introduction
Veranderingen in gastro-intestinale (GI) zenuw morfologie en dichtheid hebben de aandacht van gastro-enterologen en pathologen gevangen voor een lange tijd, maar het belang daarvan voor de pathofysiologie van GI-aandoeningen blijft onbekend 1-3. Sterker nog, een aantal zeer gemeenschappelijke GI aandoeningen zoals gastritis, refluxoesofagitis, colitis, diverticulitis en appendicitis worden geassocieerd met een verhoogde innervatie dichtheid in ontstoken weefsel gebieden 1. Er is echter geen echte aandacht tot nu toe besteed aan de mechanismen en de betekenis van neuroplasticiteit in het maag-darmkanaal. Heeft morfologisch veranderde GI zenuwen afwijken van de normale GI zenuwen, dat wil zeggen de normale toestand van het enterische zenuwstelsel, in termen van hun functie? Wat zijn de gevolgen van veranderde neuropeptide / neurotransmitter inhoud in plastic enterische zenuwen? Ofwel perifere neuroplasticiteit brengen altijd veranderde signalering naar het centrale zenuwstelsel? En waar zijn de centrale projecties van plastic extriNSIC GI zenuwbanen? Een lange reeks van dergelijke belangrijke vragen kunnen eenvoudig worden gegenereerd als we kijken naar het gebrek aan kennis over de functionele aspecten van GI neuroplasticiteit.
De studie van GI neuroplasticiteit op functioneel niveau vereist geldige, reproduceerbare en nog steeds gemakkelijk toepasbaar experimentele modellen. In een tijdperk van toenemende populariteit en acceptatie van genetisch gemanipuleerde conditionele muismodellen (GECoMM), zoals in vivo instellingen dragen het potentieel om voorheen onbekende facetten van GI neuroplasticiteit te ontrafelen in een realistische manier 1. Echter, het ontwerp en de productie van GECoMM blijft duur, arbeidsintensief en vooral tijdrovend. Bovendien, ze vereisen het a priori selectie van de doelstelling om voorwaardelijk worden gemoduleerd in de genetisch veranderde muis (zoals transgene overexpressie van zenuwgroeifactor / NGF in enterische epitheelcellen). Vandaar dat voor de desIGN van een succesvolle GECoMM, onderzoekers moeten sommige indicatoren (bv. vorige experimentele gegevens) van een waardevol doel, dat wil zeggen dat het molecuul van belang (hier NGF) ten minste kan worden verwacht om een aantal biologisch relevante effecten op de GI zenuwen uitoefenen.
Dergelijke indicatoren kunnen eenvoudig worden afgeleid uit geschikte in vitro modellen waarin geïsoleerde cel subtypes van het complex micromilieu van een in vivo systeem selectief kan worden gekweekt samen op heterotypische wijze 4-7. De modulatie van eiwitten in dergelijke heterotypische cultuur instelling gemiddeld minder technisch omslachtig, sneller, en derhalve helpen bij het voorfilteren van nuttige doelen voor verificatie in vivo studies.
Onlangs presenteerden we een in vitro neuroplasticiteit assay die werd ontworpen om te simuleren het verhoogde neurale dichtheid en hypertrofie van intrapancreatic nerves in menselijke alvleesklierkanker (PCA) en chronische pancreatitis (CP) weefsels. Hier neuronen afgeleid van pasgeboren rat dorsale wortel ganglia (DRG) of myenterische plexus (MP) werden blootgesteld aan weefselextracten van chirurgisch weggesneden PNA CP weefsels specimens en vergeleken met die gekweekt in normale humane pancreas (NP) weefselextracten 5. In plaats van weefsel extracten, kan men ook gebruik maken van cellijn bovenstaande vloeistoffen om de impact van geselecteerde celtypen op neuroplasticiteit te bestuderen. In combinatie met een gestandaardiseerde morfometrische meting de gepresenteerde neuroplasticiteit test kan bruikbaar en reproduceerbare beoordeling van neuronale plasticiteit in reactie op verschillende micro-omgevingen alvleesklier. In het bijzonder, kan de simulatie van 1) morfologische neuroplasticiteit, dus de veranderingen in de neuriet uitgroei, vertakking en neuronale maat, en 2) functionele neuroplasticiteit, dus veranderingen in de prikkelbaarheid van perifere neuronen. Bovendien zijn niet alleen randapparaat (dwz (bijv. DRG en tweede orde spinale) neuronen kunnen in de onderhavige bepalingsmethode hun morfologische en functionele reactie op verschillende inhoud GI weefsel te beoordelen. In de huidige video tutorial laten we zien het technisch protocol voor het uitvoeren van deze test en bespreken de voordelen en zwakke punten. In het bijzonder vestigen wij de aandacht op de toepasselijkheid van de fundamentele notie van deze test aan de studie van neuroplasticiteit in een GI orgel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dierlijke experimentele procedures in het protocol volgen het dier zorg richtlijnen van Technische Universität München, Duitsland.
1. Media / Extract Voorbereiding
- Tissue homogenisering
De kwaliteit van het weefsel homogenisering is cruciaal voor de daaropvolgende detectie van plastische veranderingen in de gekweekte neuronen. Hier wordt een homogenisator aanbevolen waardoor weefsel dissociatie mogelijk maakt zonder grote toename van de weefseltemperatuur.- Transfer 5 mm x 5 mm x 5 mm blokjes pancreas weefsel direct van -80 ° C tot vloeibare stikstof en in een vaste fase in het weefsel homogenator. De ideale homogenator zou het weefsel snel genoeg distantiëren, zonder dat het te ontdooien.
- Onmiddellijk na dissociatie, resuspendeer de vaste, poedervormige homogenaat in 300-500 gl 0,1 x fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS). Hier, gebruik geen lysis buffer (zoals RIPA) aangezien dit kan de neuronen lyseren.
- Centrifugeer de homogenaten gedurende ten minste 15 minuten op de maximale snelheid van uw bank centrifuge (bijv. 21.130 xg). Verzamel de heldere bovenstaande vloeistof, die het weefsel extract vertegenwoordigt.
- Cellijn supernatanten
- Laat de cellen van belang ten minste 70 te bereiken - 80% samenvloeiing in normale groeimedium.
- Meestal zijn deze media bevatten serumcomponenten en kunnen oncontroleerbare effecten uitoefenen op de groei van neuronen. Daarom, na het bereiken van de gewenste cel dichtheid, was uw cellen minstens 3x met celcultuur graad PBS en plaats ze in serum-vrij medium (SFM) voor maximaal 48 uur.
Opmerking: Hier, van mening dat sommige cellen (zoals alvleesklier stellaatcellen) serum kan nodig zijn in hun groei media om hun normale toestand en structuur te behouden. In dat geval voeren seriële verdunningen van het serum in het medium van de cel van belang om een zo laag mogelijke serumgehalte noodzakelijk intacte cel functio voorbeeldn. - Meet de eiwitconcentratie van het weefsel homogenaat of celsupernatanten via Bradford eiwittest. Hoewel deze waarden afhankelijk van het weefsel en celtype, voor alvleesklier weefselextracten, zou een concentratiebereik van 5-12 ug / ul verwacht, en cellijn supernatanten van 3-8 ug / ul.
2. Aliquot Extracten en celsupernatanten
Afhankelijk van de concentratie voor gebruik in de test, moet de uiteindelijke concentratie van het extract of supernatant in neuronale medium 100 ug / ml 5,8.
Opmerking: Voor een test met neuronen groeien in 500 pi medium in elk putje van een 24-well plaat, moet men 50 ug eiwit uit elk extract of supernatant per putje. Bij een typische extract concentratie van ongeveer 10 ug / ul, zou een 5 pl extract / supernatant nodig voor elke wel. In elke setting uitgevoerd als een drievoud, zou dit overeenkomen met 15 ul extract / supernatant. Voor verschillende weefsel of celtypen, voeren seriële verdunningen van het uiteindelijke extract of de concentratie supernatant en de waargenomen neurotrofe effecten tussen verschillende concentraties extract / supernatant vergelijken.
3. Isolatie van neuronen
Zodra de collectie extract / supernatant klaar is, doorgaan met isolatie van neuronen.
- Voor DRG neuronen, het verzamelen van de cervicale lumbale DRG van pasgeboren ratten tussen postnatale dag (P) 2-12 na onthoofding en stereomicroscopic dissectie van DRG (figuur 1A). Om voldoende DRG neuronen hebben voor een 24-well plaat, verzamel alle cervicale lumbale DRG van een pasgeboren rat (gelijk aan 52 DRG) per plaat.
- Knip de perifere (neurale) en centrale projecties (wortels) van DRG door middel van microscissors.
Het verlaten van de projecties in plaats belemmert aanwrijven en verhoogt thij contaminatie risico van cultuur door de fibroblasten.
- Knip de perifere (neurale) en centrale projecties (wortels) van DRG door middel van microscissors.
- Voor MP neuronen, weggesneden het mesenterium van de dunne darm en de hand voorzichtig strip uit de seromuscular laag van de dunne darm (voor een gedetailleerd protocol op MP isolatie, zie Schäfer et al.. 9, figuur 1B). Voor MP, het verzamelen van de plexus van twee ratten per 24-well-plaat.
Opmerking: Probeer zo zacht mogelijk zijn om scheuren in de seromuscular laag te vermijden, omdat zij de succesvolle scheiding van de dunne darm te belemmeren. - Verzamel de DRG en seromuscular laag in ijskoud minimaal essentieel medium (MEM) met gentamicine (20 mg in 500 ml medium) en metronidazol (2.5 mg in 500 ml medium) geleverd.
- Na verzameling van DRG, broeden ze in Hank's gebalanceerde zoutoplossing (HBSS) met collagenase type II gedurende 20-30 min. geleverd. Voor MP isolatie incuberen bij type collagenase tussen 1-3 uur, afhankelijk van de leeftijdvan het dier (figuur 1C).
- Voor MP, het verzamelen van de netto-achtige MP stukken onder stereomicroscoop en transfer naar ijskoude MEM.
- Vermaal dan de DRG en MP door spuiten met afnemende diameter.
Opmerking: Overmatige fijnwrijving kan de neuronen vernietigen, maar minder de gliacellen. - Zodra het medium dat de DRG of MP is geworden bewolkt, centrifuge de suspensie bij 93,9 g gedurende 5 min, gooi het medium en resuspendeer in Neurobasal medium (aangevuld met 100 U / ml penicilline, 100 ug / ml streptomycine, 0,5 mM L-glutamine en 2% B-27).
- Tel het aantal cellen (bijvoorbeeld neuronen en glia) door middel van een hemocytometer.
Opmerking: Het aantal benodigde cellen is afhankelijk van de parameter meting. Voor de kwantificering van neurieten dichtheid, moet men dichter culturen en dus een groter aantal cellen dan voor het meten van neuriet uitgroei perikaryonal maaten vertakking van individuele neuronen. Voor metingen neuriet dichtheid, gebruik bijv. 10.000 cellen (neuron + glia) / goed of 1500 neuronen / goed. Voor morfometrie op individuele neuronen, kort (1 minuut lang) trypsinatie van cellen en het zaaien van 2500 cellen / putje of 400 neuronen / goed wordt aanbevolen. De typische opbrengst van cellen verkregen van een rat is ongeveer 300.000-500.000 cellen. - Zaad de cellen op 13 mm dekglaasjes die eerder bekleed nacht en boven de putjes met Neurobasal medium (gesupplementeerd met 100 U / ml penicilline, 100 pg / ml streptomycine, 0,5 mM L-glutamine en 2% B-27) (Fig. 1D).
Opmerking: Gebruik poly-D-lysine (40 mg / m 2) OR-ornithine en laminine beklede (1 mg / ml elk) beklede dekglaasjes. Cellen hechten aan poly-D-lysine zeer snel, waardoor het geschikt is voor experimenten waarin vele cellen nodig (bijvoorbeeld neurieten dichtheidsmetingen). Gehechtheid aan laminin is in het algemeen een aantalwat zwakker, maar laminine is een sterke promotor van neuriet uitgroei. Daarom, voor metingen op neuronale vertakking en neurieten lengte liever ornithine / laminine-coating. - Toestaan dat de cellen hechten aan de putjes 's nachts. Op de volgende dag bereiden extract aangevuld medium (in een eindconcentratie extract / supernatant van 100 ug / ml).
- Zuig het zaaien medium, en het uitvoeren van een optionele, zeer zacht wassen met PBS, en dan langzaam pipet het extract /-supernatant aangevuld media (figuur 1E).
- Laat de cellen groeien voor 48 uur. Zuig de media en vast te stellen in 4% paraformaldehyde voor immuunkleuring (Figuur 1F).
- Voer dubbele immunofluorescentiekleuring behulp neuron-specifieke (bijv. beta III-tubuline) en glia-specifieke (bijv. gliale fibriallary zure eiwit / GFAP) markers (figuur 1G).
- Voor morfometrie, gebruiken een omgekeerde lichtmicroscoop uitgerust met een CCD-camera in combinatie with geautomatiseerde software die meting van neuriet dichtheid mogelijk maakt (zie tabel).
- De neurite dichtheid van neuronale culturen wordt gemeten op 4-5 representatieve microfoto bij 200x vergroting van 4 verschillende regio's van dichtste groei op elke dekglaasje door overlappen een 50 micrometer x 50 micrometer raster en het tellen van de vezel dichtheid per vierkante gemeten in de kruisende vezels. Neurietuitgroei, gemiddeld aantal takken per neuron, kan de gemiddelde tak lengte en perikaryonal maat worden gemeten van willekeurig geselecteerde 30 solitaire neuronen uit elke dekglaasje door het markeren van de neurieten en perikarya (Figuur 1H).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Morfologische neuroplasticiteit
In de aangegeven leeftijd van pasgeboren ratten (P2-12) en het zaaien dichtheden, MP en DRG neuronen reeds zeer neuronale netwerken op te bouwen na 48 uur (Figuur 2A). Vergelijking van neuriet dichtheid tussen neuronen gekweekt in prostaatkanker, CP, en NP extracten onthult groter neurite dichtheid van DRG neuronen in APC of CP-extracten dan in NP extracten (Figuur 2A) 5. We hebben vooral de voorkeur MP neuronen voor metingen op individuele neuronen, omdat MP neuronen hebben de neiging om gemakkelijker te distantiëren van omringende gliacellen dan DRG neuronen. Hier, MP neuronen gekweekt in APC of CP-extracten bouwen ook langer neurites en vertonen een meer complexe vertakkende patroon dan MP neuronen groeien in NP-extract bevattend medium (Figuur 2B) 5. Aangezien dit verschil in neuronale morfologie veroorzaakt door NP, CP en PCa extracten geeft een technisch probleem in eenssay. In de meeste gevallen kan dit worden veroorzaakt door 1) slechte kwaliteit van het bereide extract door lange verwerkingstijd of 2) door schade aan neuronen die tijdens de isolatiewerkwijze.
Functionele studies
De neuroplasticiteit test draagt hoog genoeg gevoeligheid voor veranderingen geïnduceerd door de aanwezigheid of afwezigheid van bepaalde doelmoleculen plaats in de aangevulde extracten of supernatanten detecteren. Bijvoorbeeld, de blokkade van de neurotrofe factor artemine of zenuwgroeifactor van prostaatkanker cellen (PCC) supernatanten doordat specifiek blokkerende antilichamen NGF of Dynabead-geïnduceerde depletie van artemine resulteert in vermindering van neuronale netwerkformatie (figuur 2C) 10. In een recente studie, konden we een vergelijkbaar effect voor de bijdrage van de neurotrophic factor Neurturine naar neuroplasticiteit in CP in gelijktijdige vergelijking met andere neurotrofe factoren zoals NGF, gliale-cellijn-deriv tonened neurotrophic factor (GDNF) of transforming growth factor-beta (TGF-beta) 11.
Glia
Dezelfde benadering kan ook worden toegepast op de reactie van DRG-satelliet geassocieerde gliacellen of enterische glia de alvleesklier microenvironmental inhoud beoordelen. Inderdaad, een van de meest krachtige effecten van PCa weefselextracten op DRG-of MP-geassocieerde glia prominent toename in de groei van glia (figuur 3) 5. Bovendien, dit effect is meer uitgesproken bij prostaatkanker dan CP. Hier, moet men rekening houden dat de proliferatie van gliacellen mag niet worden beoordeeld op basis van absolute glia telt, maar op het relatieve aandeel van gliacellen aan neuronen (glia-neuron-index) 5. Dit is vooral belangrijk om te overwegen omdat het aantal glia cellen in deze culturen moeilijker te controleren vanwege het groeiende kracht van glia in tegenstelling tot neuronen.
Figuur 1. Schematisch protocol van de in vitro neuroplasticiteit assay. De huidige test maakt gebruik van de pasgeboren rat ganglia (DRG) en myenterische plexus (MP) neuronen om de impact van pancreas weefsel extracten of celsupernatanten op neuronale en gliale morfologie bestuderen. DRG verzameld na laminectomie voorste en MP-bevattende seromuscular laag na resectie en mechanische verwijdering van de dunne darm (A, B). Na Type II collagenase digestie worden de neuronen uitgezaaid in de benodigde dichtheid (zie tekst voor details) ad gekweekt gedurende 24 uur (C, D). Vervolgens wordt de vers bereide pancreatische (of van een GI orgaan plaats) extracten en cel-supernatanten worden toegevoegd aan het groeimedium van neuronen op vooraf vastgestelde concentraties (E).Na 48 uur worden de culturen gefixeerd in 4% paraformaldehyde en dubbelklik immunostained tegen neuronale en gliale markers (F, G). De neuronale morfologie, waaronder neuriet dichtheid, neurale vertakking patroon en perikaryonal worden gemeten door middel van een gestandaardiseerde software-protocol (H). Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 2. Alvleesklierkanker neuroplasticiteit veroorzaakt door menselijke alvleesklierkanker (PCA) en chronische pancreatitis (CP). Menselijke pancreas weefsel extracten chirurgisch afgeleid van normale pancreas (NP), CP of prostaatkanker weefsels veroorzaken prominente verschillen in de neuriet dichtheid van DRG ne urons (A) en in de neuronale vertakking van MP neuronen (B). Hier, PSO en CP weefselextracten oefenen een prominente neurotroof effect op DRG en MP neuronen. Vergelijkbaar met weefselextracten, ook de supernatanten van individuele celtypen (hier alvleesklierkankercellen / PCC) ook opmerkelijk verhogen neurieten dichtheid van DRG neuronen (C). Deze toename is echter reversibel indien geselecteerd neurotrofe factoren zoals artemine (ARTN) of zenuwgroeifactor (NGF) uitgeput of geblokkeerd met deze supernatanten. Alle immuno neuronen tegen beta-III tubuline. Alle afbeeldingen op 100X vergroting. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
51049fig3.jpg "/>
Figuur 3. Glial reactie op alvleesklier microenvironmental inhoud. Pancreasweefsel uittreksels van prostaatkanker of CP weefsels hebben niet alleen een neurotroof effect, maar ook verbetering van gliale groei en gliacellen telt in DRG of MP culturen. Gliacellen immunostained tegen de glia marker gliale fibrillaire zuur eiwit (GFAP). Alle afbeeldingen op 200X vergroting. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het huidige protocol is bedoeld om de methode te illustreren achter de in vitro alvleesklier neuroplasticiteit test die onlangs werd ontwikkeld door onze groep om de mechanismen van neuroplasticiteit te bestuderen in PCa en CP 5. Het protocol omvat een driedaagse procedure die gemakkelijk kan worden aangebracht nadat de uitvoerder voldoende ervaring in de isolatie en de cultuur van DRG en MP neuronen heeft opgedaan. Bovendien vormt het een waardevol instrument voor het bestuderen van de gelijktijdige reactie van enterische en DRG-geassocieerde glia om alvleesklier microenvironmental componenten.
Naar onze mening, een van de meest interessante eigenschappen van deze test is de mogelijkheid om te detecteren en simuleren van de veranderingen die optreden tijdens PCa en CP (bijvoorbeeld neurale kiemen en hypertrofie) in vereenvoudigde in vitro omgeving. Inderdaad, de toepassing van weefselextracten of celsupernatanten resulteert in veranderingen in neuronale morfologie which kan worden gedetecteerd met voldoende gevoeligheid door middel van systematische morfometrische analyse. Onlangs, kunnen we ook zien dat deze test is ook gevoelig voor verschillen in de neurotrope mogelijkheden van verscheidene kanker entiteiten gelijktijdig detecteren vergelijking: Wanneer de neurotrope eigenschappen van prostaatkanker cellijnen werd vergeleken cellijnen aan colorectale kanker, prostaatkanker cellijnen significant geïnduceerd meer neurieten dichtheden onder DRG neuronen dan colorectale kanker lijnen 8. Zelfs in de vergelijking van rectale tegen colonkanker cellijnen, colonkanker cellijnen waren inferieur aan rectale kankercellen in termen van hun potentiële neuroplastic 8.
Een van de belangrijkste voordelen van deze test is de goede bereikbaarheid voor niet alleen morfometrische, maar ook elektrofysiologische analyses. In tegenstelling tot in situ neuronen in slice preparaten opnames van neuronen in onze test in gedefinieerde media of het eenbsence / over-aanwezigheid van bepaalde factoren zijn technisch niet veeleisend en kan waardevolle informatie leveren over de rol van geselecteerde moleculen in deze micro-omgevingen op de neuronale activiteit.
Zeker, de gepresenteerde test mogen niet uitsluitend beperkt tot de studie van vragen over pancreas neuroplasticiteit beschouwd. Neuroplasticiteit is een opvallend kenmerk van de gehele maagdarmkanaal onder pathologische omstandigheden, zoals inflammatoire darm neuropathieën 1-3. Al deze voorwaarden zijn gemeld te worden geassocieerd met veranderingen in innervatie morfologie en veranderde neuronale activiteit 1-3. Daarom is het denkbaar pancreas weefselextracten of cellijnen vervangen door die afgeleid van de overeenkomstige weefsels en studie van hun bijzondere gevolgen voor neuronen en glia begeleidende. Onze recente analyses op de vergelijking van alvleesklier en colorectale kanker weefsels hebben deze mogelijkheid 8. Het is echter ook aannemelijk Assume dat onderdelen van verschillende weefsel micro-omgevingen niet zo gevoelig en representatieve veranderingen kunnen induceren, zoals we regelmatig waarnemen in pancreasweefsel componenten. Daarom raden wij de vorige uitgebreide beoordeling van neuronale morfologie veroorzaakt door "positieve" controle weefsels (bijv. weefsels met oa histologisch aantoonbare neurale hypertrofie) versus "negatieve" controle weefsels (dwz zonder histologisch bewijs voor neurale hypertrofie).
Onze vroegere analyses van de reactie van glia in deze assay beperkt tot de bepaling van gliale cel tellingen in verschillende micro-omgevingen pancreas. Gliacellen bezitten toenemende belang in de neurobiologie sinds de erkenning van hun neurogene potentieel en toegenomen belangstelling calciumstromen langs gliale membraan 12. Daarom glia cellen bij deze assay zijn ook gemakkelijk toegankelijk functionele analysesdoor nieuwe benaderingen. Echter, dergelijke aanvullende innovatieve benaderingen nodig vorige uitgebreide validatie voordat hun aanvraag voor verdere studies.
Net als elke andere experimentele test, ook de gepresenteerde neuroplasticiteit test draagt een aantal beperkte vergelijkbaarheid van menselijk weefsel monsters verkregen van verschillende patiënten die een operatie ondergaan. Het is absoluut noodzakelijk voor deze weefsels te worden afgeleid uit hetzelfde weefsel regio's (bijvoorbeeld alvleesklier hoofd, van de belangrijkste tumor massa) voor betrouwbare analyses 1. Zelfs wanneer aan deze voorwaarde is voldaan, verder verschillen in weefsel of tumor biologie niet worden uitgesloten gezien de grote variatie in de biologische respons patroon van verschillende individuen 1. Om deze individuele weefsel verschillen omzeilen, adviseren wij de prestaties van de test met weefsel van zo zoveel mogelijk patiënten, dwz met ten minste 5-10 verschillende patiënten per entiteit.
Als een belangrijk technisch aspect, willen we de aandacht vestigen op de rol van de coating stoffen op de neuronale groei. Zoals ook hierboven vermeld, geven we de voorkeur poly-D-lysine voor metingen op neuriet dichtheid en ornithine / laminine coating voor degenen die op individuele neuronale vertakking / uitgroei patroon. In onze handen, terwijl meting van neuronale uitgroei ook worden uitgevoerd op poly-D-lysine bedekte oppervlakken, vinden we dat deze benadering de neiging om de gevoeligheid van de assay verlagen voor de daadwerkelijke verschillen. Daarom moeten onderzoekers die dit assay het gebruik van het optimale deklaagmateriaal hun vraag belang.
Samengevat zijn wij van mening dat de gepresenteerde neuroplasticiteit test is een waardevol instrument om snel en reproduceerbare informatie te verkrijgen over neuro-morfologie en neuro-functie in verschillende weefsels micro-omgevingen, zoals aangetoond in het voorbeeld vanpancreas weefsel. De gevoelige detectie van verschillen in de neuro-morfologie als geïnduceerd door verschillende alvleesklier inhoud weefsel onderstreept de in vitro reproduceerbaarheid van alvleesklier neuroplasticiteit in menselijke PCa en CP. Toekomstige inspanningen zijn gericht op het optimaal preassay screening van toegepaste bovenstaande vloeistoffen en extracten om de beste gedefinieerde media bereiken voor de studie van GI-ziekte-geassocieerde neuroplasticiteit.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen concurrerende belangen en geen financiële informatie.
Acknowledgments
Alle auteurs bijgedragen aan de totstandkoming en validatie van de gepresenteerde analyse en het ontwerp van het manuscript.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Poly-D-lysine hydrobromide | Sigma-Aldrich | P1149 | |
| Ornithine/laminin | Sigma-Aldrich | P2533/L4544 | |
| 13 mm Coverslips | Merck | For use in 24-well plates | |
| Dismembranator S | Sartorius | ||
| Anti-Beta-III-tubulin antibody | Millipore | MAB1637 | 1:200 concentration |
| Anti-GFAP-antibody | DAKO | M0761 | 1:400 concentration |
| RIPA buffer + protease inhibitor | Any supplier | ||
| Neurobasal medium | Gibco/Life Sciences | 21103-049 | |
| B-27 Supplement | Gibco/Life Sciences | 17504044 | Quality of B-27 is known to depend on the lot number |
| Gentamicin/Metronidazol | Any supplier | ||
| Minimal essential medium | Gibco/Life Sciences | 31095-029 | |
| Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco/Life Sciences | 24020133 | Improves collagenase activity when containing Ca/Mg |
| Collagenase type II | Worthington Biochemical | CLS-2 | Obtain lots with at least 200 U/mg activity |
| Trypsin-EDTA 0.25% | Gibco/Life Sciences | 25200056 | |
| 4% Paraformaldehyde | Any supplier | ||
| analySIS docu software | Olympus |
References
- Demir, I. E., Schafer, K. H., Tieftrunk, E., Friess, H., Ceyhan, G. O. Neural plasticity in the gastrointestinal tract: chronic inflammation, neurotrophic signals, and hypersensitivity. Acta Neuropathol. 125, 491-509 (2013).
- Vasina, V., et al. Enteric neuroplasticity evoked by inflammation. Auton. Neurosci. 126-127, 264-272 (2006).
- Lomax, A. E., Fernandez, E., Sharkey, K. A. Plasticity of the enteric nervous system during intestinal inflammation. Neurogastroenterol. Motil. 17, 4-15 (2005).
- Demir, I. E., et al. Neural Invasion in Pancreatic Cancer: The Past, Present and Future. 2, 1513-1527 (2010).
- Demir, I. E., et al. The microenvironment in chronic pancreatitis and pancreatic cancer induces neuronal plasticity. Neurogastroenterol. Motil. 22, 480-490 (2010).
- Schafer, K. H., Mestres, P. The GDNF-induced neurite outgrowth and neuronal survival in dissociated myenteric plexus cultures of the rat small intestine decreases postnatally. Exp. Brain Res. 125, 447-452 (1999).
- Schafer, K. H., Van Ginneken, C., Copray, S. Plasticity and neural stem cells in the enteric nervous system. Anat. Rec. 292, 1940-1952 (2009).
- Liebl, F., et al. The severity of neural invasion is associated with shortened survival in colon cancer. Clin. Cancer Res. 19, 50-61 (2012).
- Schäfer, K. H., Saffrey, M. J., Burnstock, G., Mestres-Ventura, P. A new method for the isolation of myenteric plexus from the newborn rat gastrointestinal tract. Brain Res. Brain Res. Protoc. 1, 109-113 (1997).
- Ceyhan, G. O., et al. Nerve growth factor and artemin are paracrine mediators of pancreatic neuropathy in pancreatic adenocarcinoma. Ann. Surg. 251, 923-931 (2010).
- Demir, I. E., et al. Neuronal plasticity in chronic pancreatitis is mediated via the neurturin/GFRalpha2 axis. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 303, 1017-1028 (2012).
- Joseph, N. M., et al. Enteric glia are multipotent in culture but primarily form glia in the adult rodent gut. J. Clin. Invest. 121, 3398-3411 (2011).
