Simulación de páncreas Neuroplasticidad:<em> In Vitro</em> Dual-neurona Plasticidad Ensayo
Summary
Plasticidad neuronal es una característica de la (GI) tracto gastrointestinal cada vez más reconocido, pero insuficientemente entendida. Aquí, en el ejemplo de trastornos pancreáticos humanos, se presenta un ensayo de neuroplasticidad in vitro para el estudio de la plasticidad neuronal en el tracto GI, tanto a nivel morfológico y funcional.
Abstract
La neuroplasticidad es una característica inherente del sistema y gastrointestinal (GI) inervación nervioso entérico en condiciones patológicas. Sin embargo, el papel fisiopatológico de la neuroplasticidad en trastornos GI sigue siendo desconocido. Modelos experimentales novedosas que permiten la simulación y la modulación de la neuroplasticidad GI pueden permitir una mayor apreciación de la contribución de la neuroplasticidad en particular las enfermedades gastrointestinales, como el cáncer de páncreas (CP) y la pancreatitis crónica (PC). Aquí, se presenta un protocolo para la simulación de la neuroplasticidad de páncreas en condiciones in vitro utilizando recién nacido ganglios dorsales de rata raíz (DRG) y el plexo mientérico (MP) neuronas. Este enfoque de doble neurona no sólo permite la monitorización de tanto la neuroplasticidad-órgano intrínseca y extrínseca-, pero también representa una herramienta valiosa para evaluar la morfología neuronal y glial y electrofisiología. Además, permite la modulación funcional de contenidos microambientales suministrados por el estudio de su impact en la neuroplasticidad. Una vez establecido, el presente ensayo neuroplasticidad tiene el potencial de ser aplicable al estudio de la neuroplasticidad en cualquier órgano GI.
Introduction
Las alteraciones en la gastrointestinal (GI) morfología del nervio y la densidad han llamado la atención de los gastroenterólogos y patólogos durante mucho tiempo, pero su relevancia para la fisiopatología de las enfermedades gastrointestinales se desconoce 1-3. De hecho, varios trastornos GI altamente comunes tales como la gastritis, la esofagitis de reflujo, la colitis, diverticulitis y apendicitis se asocian con el aumento de la densidad de inervación en áreas tejido inflamado 1. Sin embargo, hasta ahora no se ha prestado atención real a los mecanismos y significado de la neuroplasticidad en el tracto GI. ¿Los nervios GI morfológicamente alterados difieren de los nervios normales GI, es decir, el estado normal del sistema nervioso entérico, en términos de su función? ¿Cuáles son las implicaciones de la alteración del contenido de neuropéptido / neurotransmisor en los nervios entéricos de plástico? ¿Tiene la neuroplasticidad periférica siempre implica la señalización alterada para el sistema nervioso central? ¿Y dónde están las proyecciones centrales de extri plásticovías neurales GI NSIC? Una larga serie de tales preguntas clave se puede generar fácilmente cuando se mira a la escasez de nuestros conocimientos sobre los aspectos funcionales de la neuroplasticidad GI.
El estudio de la neuroplasticidad GI a nivel funcional requiere modelos experimentales válidos, reproducibles y todavía fácilmente aplicables. En una era de creciente popularidad y la aceptación de modelos de ingeniería genética condicionales de ratón (GECoMM), como en entornos in vivo tienen el potencial para dilucidar aspectos hasta ahora desconocidos de la neuroplasticidad GI de una manera realista 1. Sin embargo, el diseño y la producción de GECoMM sigue siendo costoso, laborioso y, sobre todo, requiere mucho tiempo. Además, requieren la selección a priori del objetivo a ser modulada condicionalmente en el ratón alterado genéticamente (por ejemplo, la sobreexpresión transgénica de factor de crecimiento nervioso / NGF en células epiteliales intestinales). Por lo tanto, para la design de un GECoMM éxito, los investigadores necesitan algunos indicadores (por ejemplo, datos experimentales anteriores) de un objetivo que vale la pena, es decir, que la molécula de interés (en este caso NGF) por lo menos se puede esperar para ejercer algunos efectos biológicamente relevantes sobre los nervios de GI.
Tales indicadores se puede derivar fácilmente de ser adecuada en modelos in vitro en la que los subtipos de células aisladas del complejo microambiente de un sistema in vivo se pueden cocultured selectivamente de una manera heterotípicos 4-7. La modulación de dianas moleculares en un ambiente de cultura tan heterotípica es, en promedio, técnicamente menos complicado, más rápido, y por lo tanto puede ayudar en el filtrado previo de las metas que valgan la pena para la verificación de los estudios in vivo.
Recientemente, presentamos un ensayo in vitro neuroplasticidad en el cual fue diseñado para simular el aumento de la densidad neuronal y la hipertrofia de ne intrapancreáticarves en el cáncer de páncreas humano (PCA) y pancreatitis crónica (PC) tejidos. Aquí, las neuronas derivadas de recién nacido dorsal de rata ganglios de la raíz (DRG) o plexo mientérico (MP) se expusieron a extractos de tejido de CaP resecado quirúrgicamente o CP tejidos muestras y se compararon con las cultivadas en el páncreas humano normal (NP) extractos de tejido 5. En lugar de extractos de tejidos, también se puede utilizar sobrenadantes de líneas celulares para estudiar el impacto de los tipos de células seleccionadas en la neuroplasticidad. Cuando se combina con una medición morfométrica estándar, el ensayo de la neuroplasticidad presentado permite la evaluación válida y reproducible de la plasticidad neuronal en respuesta a diferentes microambientes pancreáticas. Particularmente, se permite la simulación de 1) la neuroplasticidad morfológico, es decir, los cambios en el crecimiento de neuritas, el patrón de ramificación y tamaño neuronal, y 2) la neuroplasticidad funcional, es decir, alteraciones en la excitabilidad de las neuronas periféricas. Por otra parte, no sólo periférica (es decir </em> Entérica), sino también central (por ejemplo DRG o segundo médula orden) las neuronas se pueden incluir en el presente ensayo para evaluar su reacción morfológica y funcional a diferentes contenidos de tejido GI. En el presente video tutorial, se demuestra el protocolo técnico para la realización de este ensayo y se discuten sus ventajas y debilidades. Por otra parte, llamamos la atención sobre la aplicabilidad de la noción básica de este ensayo para el estudio de la neuroplasticidad en cualquier órgano GI.
Protocol
Representative Results
Discussion
El presente protocolo tiene por objeto ilustrar la metodología detrás del ensayo de la neuroplasticidad pancreática in vitro que fue desarrollado recientemente por nuestro grupo para estudiar los mecanismos de neuroplasticidad en el CP y CP 5. El protocolo consiste en un procedimiento de tres días que se pueden aplicar fácilmente una vez que el artista intérprete o ejecutante ha adquirido suficiente experiencia en el aislamiento y cultivo de neuronas de DRG y MP. Además, representa una herrami…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Todos los autores contribuyeron a la creación y validación de la prueba presentada y el proyecto del manuscrito.
Materials
| Poly-D-lysine hydrobromide | Sigma-Aldrich | P1149 | |
| Ornithine/laminin | Sigma-Aldrich | P2533/L4544 | |
| 13mm coverslips | Merck | For use in 24-well plates | |
| Dismembranator S | Sartorius | ||
| Anti-Beta-III-tubulin antibody | Millipore | MAB1637 | 1:200 concentration |
| Anti-GFAP-antibody | DAKO | M0761 | 1:400 concentration |
| RIPA buffer + protease inhibitor | Any supplier | ||
| Neurobasal medium | Gibco/Life sciences | 21103-049 | |
| B-27 supplement | Gibco/Life sciences | 17504044 | Quality of B-27 is known to depend on the lot number |
| Gentamicin/Metronidazol | Any supplier | ||
| Minimal essential medium | Gibco/Life sciences | 31095-029 | |
| Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco/Life sciences | 24020133 | Improves collagenase activity when containing Ca/Mg |
| Collagenase type II | Worthington Biochemical | CLS-2 | Obtain lots with at least 200U/mg activity |
| Trypsin-EDTA 0,25% | Gibco/Life sciences | 25200056 | |
| 4% Paraformaldehyde | Any supplier | ||
| analySIS docu software | Olympus |
References
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