एक कार्बनिक विद्युत ट्रांजिस्टर के साथ बैरियर ऊतक व्यवधान के सेंसिंग
Summary
कार्बनिक विद्युत ट्रांजिस्टर जीवित कोशिकाओं के साथ एकीकृत और जठरांत्र उपकला बाधा पार आयन प्रवाह की निगरानी के लिए प्रयोग किया जाता है. इस अध्ययन में, कैल्शियम chelator EGTA (इथाइलीन ग्लाइकॉल बीआईएस (बीटा aminoethyl ईथर) एन, एन, एन, 'n' टेट्रा एसिटिक की मौजूदगी से प्रेरित तंग जंक्शनों के विघटन से संबंधित आयन प्रवाह में वृद्धि हुई है, एसिड), मापा जाता है.
Abstract
जठरांत्र पथ आवश्यक आयनों और अणुओं के पारित होने की अनुमति है, जबकि रोगजनकों और विषाक्त पदार्थों के प्रवेश के खिलाफ एक शारीरिक बाधा प्रदान करता है कि बाधा ऊतक का एक उदाहरण है. इस बाधा में एक दरार कोशिकी कैल्शियम एकाग्रता में कमी की वजह से हो सकता है. कैल्शियम एकाग्रता में यह कमी paracellular प्रवाह की वृद्धि करने के लिए अग्रणी, बाधा की सीलिंग में शामिल प्रोटीन में एक गठनात्मक परिवर्तन का कारण बनता है. इस आशय की नकल करने के लिए कैल्शियम chelator इथाइलीन ग्लाइकॉल बीआईएस (बीटा aminoethyl ईथर) एन, एन, एन, 'n' टेट्रा एसिटिक एसिड (EGTA) जठरांत्र संबंधी मार्ग के प्रतिनिधि होने के लिए जाना जाता है कोशिकाओं की एक monolayer पर इस्तेमाल किया गया था. बाधा ऊतक के विघटन का पता लगाने के लिए विभिन्न तरीकों पहले से ही इस तरह के immunofluorescence और पारगम्यता assays के रूप में मौजूद हैं. हालांकि, इन तरीकों समय लेने वाली और महंगा और गतिशील या उच्च throughput माप के लिए उपयुक्त नहीं हैं. बाधा ऊतक को मापने के लिए इलेक्ट्रॉनिक तरीकेअखंडता भी transepithelial (प्रतिरोध TER) की माप के लिए मौजूद है, लेकिन ये अक्सर महंगा और जटिल हैं. बाधा ऊतक की अखंडता दवाओं की खोज और रोगज़नक़ / विष निदान में एक महत्वपूर्ण पैरामीटर के रूप में है, तेजी से सस्ता है, और संवेदनशील तरीके से विकास की तत्काल जरूरत है. बाधा ऊतक कोशिकाओं के गठन के साथ एकीकृत जैविक विद्युत ट्रांजिस्टर (OECT) गतिशील बाधा ऊतक अखंडता की निगरानी करने में सक्षम एक नई डिवाइस के रूप में दिखाया जा चुका है. डिवाइस बाधा ऊतक अखंडता का एक संकेतक के रूप में वास्तविक समय में, अभूतपूर्व अस्थायी समाधान और संवेदनशीलता के साथ ईओण प्रवाह में मिनट विविधताओं को मापने के लिए सक्षम है. इस नई विधि उच्च throughput स्क्रीनिंग अनुप्रयोगों के साथ संगत और कम लागत पर निर्मित किया जा सकता है कि एक साधारण उपकरण पर आधारित है.
Introduction
जठरांत्र उपकला शरीर के विभिन्न डिब्बों के बीच अणुओं के पारित होने को नियंत्रित करता है जो बाधा ऊतक का एक उदाहरण है. पानी और शरीर को बनाए रखने के लिए आवश्यक पोषक तत्वों की यात्रा की अनुमति है, जबकि उपकला, रोगजनकों और विषाक्त पदार्थों के खिलाफ एक शारीरिक बाधा 1 प्रदान कि प्रोटीन के परिसरों से एक साथ शामिल हो गए लम्बी स्तंभ कोशिकाओं के होते हैं. लुमेन और अंतर्निहित ऊतकों 2,3 पर लंगर कोशिकाओं के बेसल पक्ष को उजागर कोशिकाओं के शिखर की ओर: इस चयनात्मकता दो अलग झिल्ली डोमेन बनाता है जो उपकला कोशिकाओं के ध्रुवीकरण के कारण है. तंग जंक्शनों (टीजे) उपकला कोशिकाओं के शिखर भाग में मौजूद प्रोटीन के परिसरों हैं और शिखर जंक्शन 4 के रूप में जाना एक बड़ा जटिल का हिस्सा हैं. बाधा ऊतक भर आयन प्रवाह (सेल) के माध्यम से transcellular के माध्यम से या (दो सन्निकट कक्षों के बीच) एक paracellular मार्ग के माध्यम से जा सकते हैं या तो. योग कादोनों रास्ते के माध्यम से परिवहन transepithelial प्रतिरोध के रूप में जाना जाता है. शिखर जंक्शन आयनों और एक विशिष्ट उद्घाटन और समापन समारोह के माध्यम से बाधा 5,6 भर गुजर अणुओं के विनियमन के लिए जिम्मेदार है. इन प्रोटीन परिसरों की शिथिलता या विघटन अक्सर बीमारी 7-11 से संबंधित है. इसके अलावा, कई आंतों रोगजनकों / विषाक्त पदार्थों बाधा 12-14 भर आयन / पानी के प्रवाह के लिए बड़े पैमाने पर अनियंत्रण का एक परिणाम के रूप में सबसे अधिक संभावना है, जिससे शरीर में प्रवेश करने और दस्त के लिए अग्रणी, विशेष रूप से इस जटिल लक्षित करने के लिए जाना जाता है. बैरियर ऊतक भी बाह्य microenvironment बदलकर संशोधित किया जा सकता है. Cadherin सेल सेल आसंजन के लिए एक महत्वपूर्ण प्रोटीन है, और शिखर जंक्शन के गठन में शामिल है. कैल्शियम cadherin के सही संरचनात्मक रचना के लिए आवश्यक है, और बाह्य कैल्शियम में कमी सेल सेल जंक्शन के विनाश और के एक बाद उद्घाटन में परिणाम दिखाया गया हैकोशिकाओं के बीच 15 paracellular मार्ग. यह है के रूप में इस अध्ययन में, EGTA (इथाइलीन ग्लाइकॉल बीआईएस (बीटा aminoethyl ईथर) एन, एन, एन, 'n' टेट्रा एसिटिक एसिड), एक विशिष्ट कैल्शियम chelator, बाधा ऊतक में एक दरार उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया गया था आयन 16,17 प्रवाह paracellular पर एक तेजी से और कठोर प्रभाव है दिखाया गया. यह कैल्शियम chelator Caco -2 सेल लाइन का एक मिला हुआ है और विभेदित monolayer पर इस्तेमाल किया गया था. सेल संस्कृति आवेषण में सुसंस्कृत, इस सेल लाइन जठरांत्र संबंधी मार्ग की विशेषताओं को विकसित करने के लिए जाना जाता है और व्यापक रूप से दवाओं 18,19 के अवशोषण परीक्षण करने के लिए दवा उद्योग द्वारा प्रयोग किया जाता है.
बाधा ऊतक अखंडता पर नजर रखने के तरीके बहुतायत से हैं. इन विधियों शिखर जंक्शन 20 में हो जाना विशेष प्रोटीन के immunofluorescence धुंधला पर निर्भर है, या बाधा के ऊतकों को सामान्य रूप से अभेद्य है कि एक फ्लोरोसेंट ट्रेसर अणु की मात्रा का ठहराव पर निर्भर है, अक्सर ऑप्टिकल हैं21,22. एक लेबल का उपयोग कलाकृतियों उठाना, और अक्सर लागत और परख समय बढ़ सकते हैं लेकिन, जैसा कि (यानी एक fluorophore / क्रोमोफोर के बिना) लेबल से मुक्त तरीकों बेहतर कर रहे हैं. बाधा ऊतक के विद्युत, लेबल मुक्त निगरानी हाल ही में एक गतिशील निगरानी पद्धति के रूप में 23 में उभरा है. उदाहरण के लिए बिजली के प्रतिबाधा स्पेक्ट्रोस्कोपी में हाल ही में तकनीकी विकास transepithelial प्रतिरोध (आतंकवाद), सेल परत भर आयन प्रवाहकत्त्व की एक माप उपाय कर सकते हैं कि एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध स्कैनिंग तंत्र 24,25 के विकास की अनुमति दी है.
कार्बनिक इलेक्ट्रॉनिक्स इलेक्ट्रॉनिक और ईओण वाहक दोनों का संचालन कर सकते हैं कि पॉलिमर आयोजित उपयोग करके इलेक्ट्रॉनिक्स और जीव विज्ञान 26,27 28,29 की दुनिया इंटरफेस करने के लिए एक अनूठा अवसर पैदा कर दी है. OECT 30-32 का उपयोग बाधा ऊतक में उल्लंघनों का पता लगाने के लिए एक नई तकनीक हाल ही में शुरू की गई थी. इस डिवाइस मौजूदा तकनीक हमारे खिलाफ मान्य किया गया थाCellzscope का उपयोग लूसिफ़ेर पीला उपयोग कर immunofluorescence, पारगम्यता assays सहित बाधा ऊतक अखंडता, और प्रतिबाधा स्पेक्ट्रोस्कोपी का आकलन करने के लिए एड. परीक्षण सभी विषाक्त यौगिकों के मामले में, OECT बराबर या बेहतर संवेदनशीलता के साथ काम करने के लिए मिला है, और ऊपर तकनीकों वृद्धि की तुलना में अस्थायी समाधान के साथ किया गया था. इस उपकरण में, PEDOT: पी एस एस, स्थिर और 33,34 biocompatible होना दिखाया गया है कि एक आयोजन बहुलक, ट्रांजिस्टर चैनल में सक्रिय सामग्री के रूप में प्रयोग किया जाता है. OECT एक आयोजन बहुलक चैनल के दोनों तरफ नाली और स्रोत इलेक्ट्रोड से बना है. यह तो डिवाइस का एक अभिन्न हिस्सा है, जो एक इलेक्ट्रोलाइट के साथ संपर्क में रखा गया है. एक फाटक इलेक्ट्रोड इलेक्ट्रोलाइट (चित्रा 1) में डूब जाता है, और एक सकारात्मक फाटक वोल्टेज गेट पर लागू किया जाता है, जब इलेक्ट्रोलाइट से फैटायनों इस प्रकार का आयोजन बहुलक dedoping और स्रोत नाली में एक परिवर्तन के परिणामस्वरूप, चैनल के लिए मजबूर कर रहे हैं वर्तमान. डीevice इस प्रकार के कारण ट्रांजिस्टर द्वारा प्रवर्धन को आयनिक प्रवाह में मिनट में परिवर्तन के प्रति बेहद संवेदनशील है. एक सेल संस्कृति डालने पर हो एक सेल परत गेट इलेक्ट्रोड और आयोजन बहुलक चैनल के बीच रखा गया था. एक अक्षुण्ण सेल परत की उपस्थिति, नाली वर्तमान कम हो जाती है (: क्षेत्र में एक से बी करने के लिए संक्रमण चित्रा 2) फैटायनों एक अक्षुण्ण monolayer की उपस्थिति में, इसलिए, आयोजन बहुलक में प्रवेश के लिए बाधा के रूप में कार्य करता है. एक विषाक्त यौगिक की उपस्थिति में, बाधा ऊतक उत्तरोत्तर फैटायनों बहुलक फिल्म में प्रवेश दे और (: क्षेत्र सी चित्रा 2) नाली वर्तमान में वृद्धि, इसकी अखंडता खो देंगे. इस तकनीक के साथ, बाधा ऊतक में भंग monolayer भर में प्रवाह की मॉडुलन के लिए इसी नाली वर्तमान के मॉडुलन द्वारा देखा जाता है. इस उपकरण के वास्तविक समय में अभूतपूर्व अस्थायी समाधान और संवेदनशीलता के साथ ईओण प्रवाह में मिनट विविधताओं को मापने के लिए सक्षम है. यह तकनीक wilएल औषधि परीक्षण, रोग निदान या बाधा मॉडल को आसानी से अनुकूलित किया जा सकता है के रूप में बुनियादी अनुसंधान के लिए विष विज्ञान के क्षेत्र में ब्याज की हो. इस विधि को भी यह इन विट्रो मॉडल का सत्यापन विवो परीक्षण में बदलने के लिए अनुमति देता है के रूप में, पशु प्रयोग को कम करने में मदद मिलेगी.
Protocol
Representative Results
Discussion
इस तकनीक बाधा ऊतक अखंडता को मापने के लिए जीवित कोशिकाओं के साथ एक कार्बनिक विद्युत ट्रांजिस्टर एकीकृत करने के लिए एक उपन्यास विधि प्रदान करता है. इस तकनीक का मुख्य लाभ तेज़ी और संवेदनशीलता, लेकिन यह भी…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस पत्र के लेखक कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हित नहीं है.
Materials
| CLEVIOS PH 1000 | HERAUS CLEVIOS | ||
| AZ9260 resin | CIPEC SPECIALITIES | ||
| Dodecylbenzenesulfonic acid (DBSA) | Acros Organic | ||
| 3-glycidoxypropyltrimethoxysilane (GOPS) | Sigma Aldrich | ||
| 24-well Suspended cell Culture insert Millicell PET 0.4 μm Millipore | Dominique dutscher | 51705 | |
| 24-well cell culture plate BD Falcon | Dominique dutscher | 51705 | |
| STERICUP-GP PES 0.22 μM | Dominique dutscher | 51246 | |
| ADVANCED DMEM Marque GIBCO | Fisher scientific | E3434T | |
| FBS HEAT INACT. S.AMERICAN | Fisher scientific | E3387M | |
| PENICILLIN STREPTOMYCIN | Fisher scientific | E3470C | |
| GLUTAMAX | Fisher scientific | E3524T | |
| TRYPSIN 0.05% EDTA | Fisher scientific | E3513N | |
| EGTA (Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid) | Sigma Aldrich | E4378 | |
| ETHYLENE GLYCOL, ANHYDROUS, 99.8%, | Sigma aldrich | ||
| Caco-2 cells | ATCC | ||
| PDMS | Dow corning | SYLGARD 184 SILICONE ELASTOMER | |
| Au (99.99%) | NEYCO | AU3X6 | |
| Chromium (99.95%) | NEYCO | ||
| Parylene C | Specialty Coating Systems | ||
| Ag/AgCl wire | HARVARD APPARATUS | ||
| Photoresist | CIPEC SPECIALITIES | Résine AZ9260 |
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