Organik Elektrokimyasal Transistör Bariyer Doku bozulması ve Algılama
Summary
Organik Elektrokimyasal Transistor canlı hücreler ile entegre ve mide-bağırsak epitelyal bariyer boyunca iyon akışı izlemek için kullanılır. Bu çalışmada, kalsiyum kenetleme maddesi EGTA (etilen glikol-bis (beta-aminoetil eter)-N, N, N ', N'-tetra asetik asit varlığı ile indüklenen sıkı birleşme bozulması ile ilişkili iyon akışında bir artış, asit), ölçülür.
Abstract
Gastrointestinal sistem, gerekli iyon ve moleküllerin geçişine izin verirken, patojen ve toksinlerin girişine karşı fiziksel bir engel oluşturur bariyer doku bir örnektir. Bu bariyer bir kırılma hücre dışı kalsiyum konsantrasyonunda bir azalmaya neden olabilir. Kalsiyum konsantrasyonundaki bu azalma, paraselüler akısının bir artışa yol açan, bariyerin mühürlenmesi ile ilgili proteinlerin yapısal bir değişikliğe neden olmaktadır. Bu etkisini taklit etmek için kalsiyum kenetleme maddesi, etilen glikol-bis (beta-aminoetil eter)-N, N, N ', N'-tetra asetik asit (EGTA), gastrointestinal sistemin temsili olarak bilinen hücrelerin bir mono-tabakası üzerinde kullanıldı. Bariyer dokusunun bozulması tespit etmek için farklı yöntemler daha önce bu imüno ve geçirgenlik deneyleri gibi, mevcuttur. Ancak, bu metodlar zaman alıcı ve pahalı ve dinamik veya yüksek verimlilik ölçümleri için uygun değildir. Bariyer doku ölçülmesi için elektronik yöntemlerbütünlüğü de transepitelyal direnci (TER) ölçülmesi için mevcut, ancak bu genellikle pahalı ve karmaşıktır. Bariyer doku bütünlüğü ilaç keşfi ve patojen / toksin teşhis önemli bir parametre olduğu, ucuz, hızlı ve hassas yöntemlerinin geliştirilmesi acilen ihtiyaç vardır. Bariyer doku oluşturan hücreler ile entegre Organik elektrokimyasal transistör (OECT) dinamik bariyer doku bütünlüğünün izleme yeteneğine sahip yeni bir cihaz olarak gösterilmiştir. Cihaz bariyer doku bütünlüğünün bir göstergesi olarak, gerçek zamanda, görülmemiş zamansal çözünürlük ve hassasiyet ile iyonik flux dakika varyasyonları ölçmek mümkün değildir. Bu yeni yöntem, yüksek veri akışı tarama uygulamaları ile uyumlu olması ve düşük maliyetle imal edilmiş olabilir, basit bir cihaz dayanmaktadır.
Introduction
Mide-bağırsak epiteli, vücudun çeşitli kompartmanlar arasında moleküllerin geçişini kontrol bariyer doku, bir örneğidir. Su ve vücut sürdürmek için gerekli besin geçişine izin verirken epitelyum, patojenler ve toksinlere karşı fiziksel bir engel sağlamak 1 proteinlerin kompleksleri ile birbirine uzatılmış sütun hücrelerden oluşur. Lumen ve alttaki dokulara 2,3 üzerine bağlanan hücrelerin bazal tarafına maruz kalan hücrelerin tepe tarafı: Bu seçicilik, iki farklı membran etki yaratır epitel hücrelerinin polarizasyon, kaynaklanmaktadır. Sıkı bağlantıları (TJ) epitel hücrelerinin apikal kısmı mevcut proteinlerin kompleksleri olan ve apikal birleşme 4 olarak bilinen büyük bir kompleks bir parçasıdır. Bariyer doku boyunca iyon akışı (hücre yoluyla) ile veya hücre üzerinden (iki bitişik hücreler arasında) bir paraselüler yolu ile ya da gidebilir. ToplamıHer iki yol izleri üzerinden taşıma transepitelyal direnç olarak da bilinir. Apikal birleşme iyonları ve belirli bir açma ve kapama fonksiyonu ile bariyer 5,6 geçerken moleküllerin düzenlenmesinden sorumludur. Bu protein komplekslerinin bir fonksiyon bozukluğu ya da rahatsızlığın çoğunlukla hastalık 7-11 ile ilgilidir. Buna ek olarak, çok sayıda enterik patojenler / toksinler bariyer 12-14 arasında iyon / su akışının büyük bozukluğunun bir sonucu olarak, büyük olasılıkla bu şekilde vücuda giren ve ishale yol açan, özellikle bu kompleks hedef bilinmektedir. Bariyer dokusu, aynı zamanda, hücre dışı mikro-değiştirilerek değiştirilebilir. Kaderin hücre-hücre yapışması için önemli bir protein olduğunu ve apikal birleşme oluşumunda yer almaktadır. Kalsiyum Cadherin doğru yapısal uyum için gereklidir, ve hücre dışı kalsiyum olarak bir azalma, hücre-hücre birleşme yıkılması ve takip eden bir açılış ile sonuçlandığı gösterilmiştirHücrelerin 15 arasında paraselüler yolu. O olduğu gibi, bu çalışmada, EGTA (etilen glikol-bis (beta-aminoetil eter)-N, N, N ', N'-tetra asetik asit), spesifik bir kalsiyum kenetleme maddesi, bariyer dokuda ihlali indüklemek için kullanılmıştır iyon 16,17 akış paraselüler üzerinde hızlı ve şiddetli bir etkisi olduğu gösterilmiştir. Bu, kalsiyum kenetleyici Caco-2 hücre hattının bir belirsiz ve farklı tek tabaka kullanılmıştır. Hücre kültürü içinde uçlar kültürlü, bu hücre çizgisi, gastrointestinal sistemin özelliklerini geliştirmek için yaygın olarak bilinen ve ilaç 18,19 emilimini test etmek için, farmasötik endüstrisinde kullanılır.
Bariyer doku bütünlüğünü izlemek için yöntemler bol vardır. Bu yöntemler, apikal birleşme 20 ° olduğu bilinen belirli proteinlerin immünofloresan boyama dayanarak ya da bariyer dokuya normal geçirimsiz olan, bir floresanlı işaretleyici molekülün miktarının dayanarak, genellikle optik vardır21,22. Bir etiketin kullanımı eserler tabi ve genellikle maliyet ve deney süresi artar gibi Ancak, (örneğin bir florofor / kromofor olmayan) bir etiket içermeyen yöntemleri tercih edilir. Bariyer doku Elektrikli, etiketi içermeyen son izleme dinamik bir izleme yöntemi 23 olarak ortaya çıkmıştır. Örneğin, elektrik empedansı spektroskopisi son zamanlardaki teknolojik ilerlemeler transepitelyal direnci (TER), hücre tabakası boyunca iyon iletkenliği bir ölçüm ölçebilen bir ticari olarak temin edilebilir bir tarama cihazının 24,25 gelişimini sağladı.
Organik elektronik, elektronik ve iyonik taşıyıcılar hem de gerçekleştirebilirsiniz iletken polimerler kullanarak elektronik ve biyoloji 26,27 28,29 dünyasını arayüzü için eşsiz bir fırsat yarattı. OECT 30-32 kullanarak bariyer dokusunda ihlallerini tespit etmek için yeni bir yöntem son zamanlarda kullanılmaya başlandı. Bu cihaz, mevcut tekniklerin bize karşı valide edildiCellzscope kullanarak Lucifer sarı kullanarak immünofloresan, geçirgenlik deneyleri de dahil olmak üzere doku bariyer bütünlüğünü ve empedans spektroskopisi değerlendirmek ed. Test edilen tüm toksik bileşiklerin durumunda, OECT eşit ya da daha iyi bir hassasiyetle çalıştığı bulunan ve yukarıdaki yöntemlere göre artan zamansal çözünürlüğe sahip oldu. Bu cihazda, PEDOT: PSS, kararlı ve biyolojik olarak uyumlu 33,34 olduğu gösterilen bir iletken polimer, transistörün kanalı içinde aktif madde olarak kullanılır. OECT bir iletken polimer kanalın her iki tarafındaki boşaltma ve kaynak elektrotları oluşmaktadır. Bu da, cihazın bir parçasını oluşturan bir elektrolit ile temas halinde yerleştirilir. Bir kapı elektrot, elektrolit (Şekil 1) içine daldırılır ve bir pozitif kapı voltajı kapısında uygulandığında, elektrolitten katyonları ve böylece iletken polimer dedoping ve kaynak-drenaj bir değişiklik ile ortaya çıkan, kanal içine zorlanır akımı. Device böylece nedeniyle transistör amplifikasyon iyonik akı dakika değişiklikleri son derece duyarlıdır. , Bir hücre kültürü eki üzerinde büyümüş bir hücre tabakası kapı elektrodu ile iletken polimer kanal arasında yerleştirilmiştir. Bozulmamış bir hücre tabakasının varlığı, boşaltma akımı azalır (: bölge A'dan b geçiş Şekil 2) katyonları sağlam bir tek tabaka mevcudiyetinde, bu nedenle, iletken polimer içine girmek için bir bariyer görevi görür. Zehirli bir bileşiğin varlığında, bariyer doku aşamalı katyonları polimer filmin içine girmek sağlayarak ve (: c bölge Şekil 2), boşaltma akımını artırarak, bütünlüğünü kaybeder. Bu teknik ile, bariyer dokuda ihlal tek tabaka üzerinde akısının modülasyonu karşılık gelen, boşaltma akımının modülasyonu tarafından görülür. Bu cihaz, gerçek zamanlı olarak görülmemiş zamansal çözünürlük ve hassasiyet ile iyonik flux dakika varyasyonları ölçmek mümkün değildir. Bu teknoloji, Will uyuşturucu testi, hastalığın teşhis veya bariyer modeli kolayca adapte edilebilir gibi temel araştırma için toksikoloji alanında ilgi. Bu yöntem, aynı zamanda in vitro modellerin doğrulama vivo test yerine sağlar olarak, deney hayvan azaltmaya yardımcı olacaktır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu teknik engel doku bütünlüğünü ölçmek için, canlı hücreler ile bir organik elektrokimyasal transistör entegre etmek için yeni bir yöntem sağlamaktadır. Bu tekniğin başlıca avantajları hızlılığı ve hassasiyet değil, aynı zamanda dinamik bariyer doku izlenmesi için, cihazın düşük maliyetli vardır.
Bu yöntem, canlı hücreleri kullanır gibi, kritik bir noktaya sağlam bir bariyer katmanı temsil eden bir tek tabaka, kullandığınızdan emin olmaktır. Bariy…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışmanın yazarları, herhangi bir rakip mali çıkarları yoktur.
Materials
| CLEVIOS PH 1000 | HERAUS CLEVIOS | ||
| AZ9260 resin | CIPEC SPECIALITIES | ||
| Dodecylbenzenesulfonic acid (DBSA) | Acros Organic | ||
| 3-glycidoxypropyltrimethoxysilane (GOPS) | Sigma Aldrich | ||
| 24-well Suspended cell Culture insert Millicell PET 0.4 μm Millipore | Dominique dutscher | 51705 | |
| 24-well cell culture plate BD Falcon | Dominique dutscher | 51705 | |
| STERICUP-GP PES 0.22 μM | Dominique dutscher | 51246 | |
| ADVANCED DMEM Marque GIBCO | Fisher scientific | E3434T | |
| FBS HEAT INACT. S.AMERICAN | Fisher scientific | E3387M | |
| PENICILLIN STREPTOMYCIN | Fisher scientific | E3470C | |
| GLUTAMAX | Fisher scientific | E3524T | |
| TRYPSIN 0.05% EDTA | Fisher scientific | E3513N | |
| EGTA (Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid) | Sigma Aldrich | E4378 | |
| ETHYLENE GLYCOL, ANHYDROUS, 99.8%, | Sigma aldrich | ||
| Caco-2 cells | ATCC | ||
| PDMS | Dow corning | SYLGARD 184 SILICONE ELASTOMER | |
| Au (99.99%) | NEYCO | AU3X6 | |
| Chromium (99.95%) | NEYCO | ||
| Parylene C | Specialty Coating Systems | ||
| Ag/AgCl wire | HARVARD APPARATUS | ||
| Photoresist | CIPEC SPECIALITIES | Résine AZ9260 |
References
- Farquhar, M. G., Palade, G. E. Junctional complexes in various epithelia. J. Cell Biol. 17, 375-412 (1963).
- Gaillard, J. L., Finlay, B. B. Effect of cell polarization and differentiation on entry of Listeria monocytogenes into the enterocyte-like Caco-2 cell line. Infect. Immun. 64, 1299-1308 (1996).
- Anderson, J. M., Balda, M. S., Fanning, A. S. The structure and regulation of tight junctions. Curr. Opin. Cell Biol. 5, 772-778 (1993).
- Guttman, J. A., Finlay, B. B. Tight junctions as targets of infectious agents. Biochim. Biophys. Acta. 1788, 832-841 (2009).
- Anderson, J. M. Molecular structure of tight junctions and their role in epithelial transport. News. Physiol. Sci. 16, 126-130 (2001).
- Anderson, J. M., Van Itallie, C. M. Tight junctions: Closing in on the seal. Curr. Biol. 9, (1999).
- Ma, T. Y., Boivin, M. A., Ye, D., Pedram, A., Said, H. M. Mechanism of TNF-{alpha} modulation of Caco-2 intestinal epithelial tight junction barrier: role of myosin light-chain kinase protein expression. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 288, 422-430 (2005).
- Schulzke, J. D., et al. Epithelial tight junctions in intestinal inflammation. Ann. N.Y. Acad. Sci. 1165, 294-300 (2009).
- Fisher, S. J., Swaan, P. W., Eddington, N. D. The ethanol metabolite acetaldehyde increases paracellular drug permeability in vitro and oral bioavailability in vivo. The J. Pharmacol. Exp. Therap. 332, 326-333 (2010).
- Ma, T. Y., Nguyen, D., Bui, V., Nguyen, H., Hoa, N. Ethanol modulation of intestinal epithelial tight junction barrier. Am. J. Physiol. 276, 965-974 (1999).
- Nemeth, E., Halasz, A., Barath, A., Domokos, M., Galfi, P. Effect of hydrogen peroxide on interleukin-8 synthesis and death of Caco-2 cells. Immunopharmacol. Immunotoxicol. 29, 297-310 (2007).
- Vogelmann, R., Amieva, M. R., Falkow, S., Nelson, W. J. Breaking into the epithelial apical-junctional complex–news from pathogen hackers. Curr. Opin. Cell Biol. 16, 86-93 (2004).
- Nusrat, A., et al. Clostridium difficile toxins disrupt epithelial barrier function by altering membrane microdomain localization of tight junction proteins. Infect. Immun. 69, 1329-1336 (2001).
- Obert, G., Peiffer, I., Servin, A. L. Rotavirus-induced structural and functional alterations in tight junctions of polarized intestinal Caco-2 cell monolayers. J. Virol. 74, 4645-4651 (2000).
- Nagar, B., Overduin, M., Ikura, M., Rini, J. M. Structural basis of calcium-induced E-cadherin rigidification and dimerization. Nature. 380, 360-364 (1996).
- Boulenc, X., et al. Importance of the paracellular pathway for the transport of a new bisphosphonate using the human Caco-2 monolayers model. Biochem. Pharmacol. 46, 1591-1600 (1993).
- Artursson, P., Magnusson, C. Epithelial transport of drugs in cell culture. II: Effect of extracellular calcium concentration on the paracellular transport of drugs of different lipophilicities across monolayers of intestinal epithelial (Caco-2) cells. J. Pharm. Sci. 79, 595-600 (1990).
- Artursson, P. Epithelial transport of drugs in cell culture. I: A model for studying the passive diffusion of drugs over intestinal absorptive (Caco-2) cells. J. Pharm. Sci. 79, 476-482 (1990).
- Artursson, P., Karlsson, J. Correlation between oral drug absorption in humans and apparent drug permeability coefficients in human intestinal epithelial (Caco-2) cells. Biochem. Biophys. Res. Commun. 175, 880-885 (1991).
- Balda, M. S., et al. Functional dissociation of paracellular permeability and transepithelial electrical resistance and disruption of the apical-basolateral intramembrane diffusion barrier by expression of a mutant tight junction membrane protein. J. Cell Biol. 134, 1031-1049 (1996).
- Hubatsch, I., Ragnarsson, E. G. E., Artursson, P. Determination of drug permeability and prediction of drug absorption in Caco-2 monolayers. Nat. Protoc. 2, 2111-2119 (2007).
- Uchida, M., Fukazawa, T., Yamazaki, Y., Hashimoto, H., Miyamoto, Y. A modified fast (4 day) 96-well plate Caco-2 permeability assay. J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 59, 39-43 (2008).
- Krug, S. M., Fromm, M., Gunzel, D. Two-Path Impedance Spectroscopy for Measuring Paracellular and Transcellular Epithelial Resistance. Biophys. J. 97, 2202-2211 (2009).
- Wegener, J., Abrams, D., Willenbrink, W., Galla, H. J., Janshoff, A. Automated multi-well device to measure transepithelial electrical resistances under physiological conditions. BioTechniques. 37, 592-594 (2004).
- Weber, C. R., Shen, L., Wu, L., Wang, Y., Turner, J. R. Occludin is Required for Tumor Necrosis Factor (TNF)-Mediated Regulation of Tight Junction (TJ) Barrier Function. Gastroenterology. 140, (2011).
- Owens, R. M., Malliaras, G. G. Organic electronics at the interface with biology. MRS Bull. , (2010).
- Lin, P., Yan, F., Yu, J. J., Chan, H. L. W., Yang, M. The Application of Organic Electrochemical Transistors in Cell-Based Biosensors. Adv. Mater. 22, 3655-3660 (2010).
- White, H. S., Kittlesen, G. P., Wrighton, M. S. Chemical Derivatization of an Array of 3 Gold Microelectrodes with Polypyrrole – Fabrication of a Molecule-Based Transistor. J. Am. Chem. Soc. 106, 5375-5377 (1984).
- Bernards, D. A., Malliaras, G. G. Steady-state and transient behavior of organic electrochemical transistors. Adv. Funct. Mater. 17, 3538-3544 (2007).
- Jimison, L. H., et al. Measurement of Barrier Tissue Integrity with an Organic Electrochemical Transistor. Adv. Mater. 24, 5919-5923 (2012).
- Tria, S., Jimison, L. H., Hama, A., Bongo, M., Owens, R. M. Sensing of EGTA Mediated Barrier Tissue Disruption with an Organic Transistor. Biosensors. 3, 44-57 (2013).
- Tria, S. A., Jimison, L. H., Hama, A., Bongo, M., Owens, R. M. Validation of the organic electrochemical transistor for in vitro toxicology. Biochim. Biophys. Acta. 1830, 4381-4390 (2013).
- Zhu, Z. T., et al. A simple poly(3,4-ethylene dioxythiophene)/poly(styrene sulfonic acid) transistor for glucose sensing at neutral pH. Chem. Commun. , 1556-1557 (2004).
- Lin, P., Yan, F., Yu, J., Chan, H. L., Yang, M. The application of organic electrochemical transistors in cell-based biosensors. Adv. Mater. 22, 3655-3660 (2010).
