Sensoriamento de Barreira rompimento do tecido com um transistor Eletroquímica Orgânica
Summary
O transistor Electrochemical orgânica é integrado com células vivas e utilizado para monitorizar o fluxo de iões através da barreira epitelial gastrointestinal. Neste estudo, um aumento no fluxo de iões, relacionada com a ruptura das junções apertadas, induzida pela presença de EGTA quelante de cálcio (ácido etileno glicol-bis (éter de beta-aminoetilo)-N, N, N ', N'-tetra-acético ácido), é medida.
Abstract
O tracto gastrointestinal é um exemplo do tecido de barreira, que proporciona uma barreira física contra o ingresso de agentes patogénicos e toxinas, enquanto permitindo a passagem de iões e moléculas necessárias. A quebra neste barreira pode ser causada por uma redução na concentração de cálcio extracelular. Esta redução na concentração de cálcio provoca uma alteração conformacional nas proteínas envolvidas na vedação da barreira, o que leva a um aumento do fluxo paracelular. Para imitar o efeito do cálcio nos quelantes ácido etileno glicol-bis (éter de beta-aminoetilo)-N, N, N ', N'-ácido acético tetra (EGTA) foi usado em uma monocamada de células que se sabe ser representativa do tracto gastrointestinal. Já existem métodos para detectar o rompimento do tecido de barreira, tais como os ensaios de imunofluorescência e de permeabilidade. No entanto, estes métodos são demorados e dispendiosos e não é adequado para as medições dinâmicas ou de alto rendimento. Métodos eletrônicos para medir o tecido barreiraintegridade existem também para a medição da resistência transepitelial (TER), no entanto, estes são muitas vezes dispendioso e complexo. O desenvolvimento de métodos rápidos, baratos e sensíveis é urgentemente necessário, pois a integridade do tecido barreira é um parâmetro fundamental na descoberta de medicamentos e diagnósticos patógeno / toxina. O transístor eletroquímico orgânico (OECT) integrado com tecido barreira células formadoras tem sido mostrado como um novo dispositivo capaz de monitorar de forma dinâmica a integridade do tecido de barreira. O dispositivo é capaz de medir pequenas variações no fluxo iónico com resolução temporal sem precedentes e sensibilidade, em tempo real, como um indicador da integridade do tecido de barreira. Este novo método é baseado num dispositivo simples que pode ser compatível com aplicações de rastreio de elevada capacidade e fabricada a baixo custo.
Introduction
O epitélio gastrintestinal é um exemplo do tecido de barreira, a qual controla a passagem das moléculas entre os diferentes compartimentos do corpo. O epitélio constituído por células colunares alongadas unidas por complexos de proteínas que proporcionem uma barreira física 1 contra agentes patogénicos e toxinas, enquanto permitindo a passagem de água e os nutrientes necessários para sustentar o organismo. Esta selectividade é devido à polarização das células epiteliais, o que cria dois domínios de membrana diferentes: o lado apical das células expostas à luz, e o lado basal das células ancoradas nos tecidos subjacentes 2,3. Tight junctions (TJ) são complexos de proteínas presentes na porção apical das células epiteliais e são parte de um complexo maior conhecida como a junção apical 4. O fluxo de íons através do tecido de barreira pode ou ir através do transcelular (através do celular) ou via um paracelular (entre duas células adjacentes) via. A somao transporte através de ambas as vias é conhecida como a resistência transepitelial. A junção apical é responsável pela regulação de íons e moléculas que passam através da barreira de 5,6 por meio de uma abertura específica e função de fechamento. Uma disfunção ou perturbação destes complexos de proteína é muitas vezes relacionados com a doença 7-11. Além disso, muitos patógenos entéricos / toxinas são conhecidos por atingir especificamente esse complexo, entrando assim o corpo e levando a diarréia, provavelmente como consequência da desregulação maciça de fluxo de íons / água através da barreira 12-14. Tecido de barreira pode também ser modificado, alterando o microambiente extracelular. Caderina é uma proteína crítica para a adesão célula-célula, e está envolvido na formação da junção apical. O cálcio é necessário para a conformação estrutural correcta da caderina, e uma diminuição no cálcio extracelular foi mostrado para provocar a destruição da junção célula-célula e uma abertura subsequente dovia paracelular entre as células 15. Neste estudo, EGTA (etileno-glicol-bis (beta-amino-etil éter)-N, N, N ', N' ácido acético, tetra-), um quelante de cálcio específico, foi utilizada para induzir a quebra da barreira de tecido, uma vez que possui mostrado ter um efeito drástico sobre a rápida e paracelular de iões fluem 16,17. Esse quelante de cálcio foi utilizado em uma monocamada confluente e diferenciado da linha celular Caco-2. Cultivados em inserções de cultura de células, é conhecido nesta linha de células para o desenvolvimento das características do tracto gastrointestinal e é amplamente utilizado na indústria farmacêutica para testar a absorção de fármacos 18,19.
Métodos para monitorar a integridade do tecido barreira são abundantes. Estes métodos são muitas vezes óptico, baseando-se coloração por imunofluorescência de proteínas particulares conhecidos como sendo na junção apical 20, ou baseando-se na quantificação de uma molécula de marcador fluorescente que é normalmente impermeável ao tecido de barreira21,22. No entanto, os métodos de livre-etiqueta (isto é, sem um fluoróforo / cromóforo) são preferíveis, como o uso de um rótulo pode incorrer artefactos, e frequentemente aumenta o custo e tempo de ensaio. Elétrica, monitoramento sem etiqueta de tecido barreira surgiu recentemente como um método de monitoramento dinâmico 23. Por exemplo, os recentes avanços tecnológicos na espectroscopia de impedância eléctrica têm permitido o desenvolvimento de um aparelho de digitalização comercialmente disponíveis 24,25 que pode medir a resistência transepitelial (TER), uma medição da condutância de iões através da camada de células.
A eletrônica orgânica criou uma oportunidade única para interagir no mundo da eletrônica e biologia 26,27 28,29 usando polímeros condutores que podem conduzir ambas as companhias eletrônicas e iônicas. Uma nova técnica para detectar falhas no tecido barreira usando o OECT 30-32 foi recentemente introduzido. Este dispositivo foi validado contra as técnicas existentes nosed para avaliar a integridade da barreira de tecido, inclusive de imunofluorescência, ensaios de permeabilidade utilizando Lúcifer amarelo, e espectroscopia de impedância usando o Cellzscope. No caso de todos os componentes tóxicos testados, o OECT foi encontrado a operar com uma sensibilidade igual ou melhor, e com o aumento da resolução temporal, em comparação com as técnicas anteriores. Neste dispositivo, PEDOT: PSS, um polímero condutor que tem sido mostrado para ser estável e biocompatível 33,34, é usado como o material activo no canal de transístor. O OECT é composto por eléctrodos de dreno e fonte de cada lado de um canal de polímero condutor. Este é, então, colocada em contacto com um electrólito, o qual constitui parte integrante do dispositivo. Um eléctrodo de porta é imerso no electrólito (Figura 1), e, quando uma tensão de porta positiva é aplicada à porta, catiões de electrólito é forçado para dentro do canal, dedoping assim o polímero condutor, resultando numa alteração na fonte-dreno corrente. O device é, portanto, extremamente sensível a pequenas mudanças no fluxo iónico devido à amplificação do transistor. A camada de células cultivadas em uma inserção de cultura de células foi colocada entre o eléctrodo de porta e o canal de polímero condutor. A presença de uma camada de células intactas actua como barreira para os catiões de entrar no polímero condutor, por conseguinte, na presença de uma monocamada intacta, as quedas de corrente de drenagem (Figura 2: transição da região A para B). Na presença de um composto tóxico, o tecido de barreira vai perder gradualmente a sua integridade, deixando os catiões introduzir na película de polímero e aumentar a corrente de drenagem (Figura 2: região c). Com esta técnica, a ruptura do tecido de barreira é visto pela modulação da corrente de escoamento, correspondente à modulação do fluxo através da monocamada. Este dispositivo é capaz de medir pequenas variações no fluxo iônico com resolução temporal sem precedentes e sensibilidade em tempo real. Este wil tecnologial ser de interesse no domínio da toxicologia para o teste de drogas, diagnóstico de doenças ou pesquisa básica como o modelo de barreira pode ser facilmente adaptado. Este método também ajudará a reduzir a experimentação animal, uma vez que permite a validação de modelos in vitro para substituir os ensaios in vivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Esta técnica proporciona um novo método para integrar um transistor eletroquímico orgânica com células vivas para medir a integridade do tecido de barreira. As principais vantagens desta técnica são a rapidez e sensibilidade, mas também do baixo custo do dispositivo de monitorização dinâmica de tecido de barreira.
Como este método usa células vivas, um ponto crítico é ter a certeza de usar uma monocamada, o que representa uma camada de barreira intacta. Os parâmetros da barre…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores deste trabalho não tem quaisquer interesses financeiros concorrentes.
Materials
| CLEVIOS PH 1000 | HERAUS CLEVIOS | ||
| AZ9260 resin | CIPEC SPECIALITIES | ||
| Dodecylbenzenesulfonic acid (DBSA) | Acros Organic | ||
| 3-glycidoxypropyltrimethoxysilane (GOPS) | Sigma Aldrich | ||
| 24-well Suspended cell Culture insert Millicell PET 0.4 μm Millipore | Dominique dutscher | 51705 | |
| 24-well cell culture plate BD Falcon | Dominique dutscher | 51705 | |
| STERICUP-GP PES 0.22 μM | Dominique dutscher | 51246 | |
| ADVANCED DMEM Marque GIBCO | Fisher scientific | E3434T | |
| FBS HEAT INACT. S.AMERICAN | Fisher scientific | E3387M | |
| PENICILLIN STREPTOMYCIN | Fisher scientific | E3470C | |
| GLUTAMAX | Fisher scientific | E3524T | |
| TRYPSIN 0.05% EDTA | Fisher scientific | E3513N | |
| EGTA (Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid) | Sigma Aldrich | E4378 | |
| ETHYLENE GLYCOL, ANHYDROUS, 99.8%, | Sigma aldrich | ||
| Caco-2 cells | ATCC | ||
| PDMS | Dow corning | SYLGARD 184 SILICONE ELASTOMER | |
| Au (99.99%) | NEYCO | AU3X6 | |
| Chromium (99.95%) | NEYCO | ||
| Parylene C | Specialty Coating Systems | ||
| Ag/AgCl wire | HARVARD APPARATUS | ||
| Photoresist | CIPEC SPECIALITIES | Résine AZ9260 |
References
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