उच्च थ्रूपुट/उच्च सामग्री स्क्रीनिंग के लिए अनुकूलित इंट्रासेलुलर माइकोबैक्टीरिया के क्वांटिफिकेशन के लिए एक सूक्ष्म फेनोटाइपिक परख
Summary
यहां, हम छोटे हस्तक्षेप सिंथेटिक आरएनए (सिरना), रासायनिक यौगिक, और Mycobacterium तपेदिक उत्परिवर्ती पुस्तकालयों के उच्च थ्रूपुट/उच्च सामग्री स्क्रीन के लिए लागू एक फेनोटाइपिक परख का वर्णन करते हैं । यह विधि फ्लोरोसेंटली लेबल वाले माइकोबैक्टीरियम तपेदिक का पता लगाने पर निर्भर करती है, जो स्वचालित कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके फ्लोरोसेंटली लेबल वाली मेजबान सेल है।
Abstract
चिकित्सा और वैक्सीन की उपलब्धता के बावजूद, तपेदिक (टीबी) दुनिया में सबसे घातक और व्यापक जीवाणु संक्रमण में से एक बना हुआ है । कई दशकों के बाद से, बहु और बड़े पैमाने पर दवा प्रतिरोधी उपभेदों के अचानक फट तपेदिक के नियंत्रण के लिए एक गंभीर खतरा है । इसलिए, तपेदिक के कारक एजेंट, माइकोबैक्टीरियम तपेदिक (एमटीबी)के लिए महत्वपूर्ण नए लक्ष्यों और रास्तों की पहचान करना और टीबी की दवाओं बनने वाले उपन्यास रसायनों की खोज करना आवश्यक है। एक दृष्टिकोण के लिए बड़े पैमाने पर पुस्तकालयों के आनुवंशिक और रासायनिक स्क्रीन के लिए उपयुक्त तरीकों की स्थापना के लिए एक घास का ढेर में एक सुई की खोज को सक्षम करने के लिए है । इस उद्देश्य के लिए, हमने स्वचालित कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके फ्लोरोसेंटली लेबल वाली मेजबान कोशिकाओं के भीतर फ्लोरोसेंटली लेबल एमटीबी का पता लगाने पर निर्भर एक फेनोटाइपिक परख विकसित की। यह इन विट्रो परख मेजबान में एमटीबी की उपनिवेशीकरण प्रक्रिया की एक छवि आधारित मात्राकरण की अनुमति देता है और 384-वेल माइक्रोप्लेट प्रारूप के लिए अनुकूलित किया गया था, जो सिरना-, रासायनिक यौगिक या एमटीबी उत्परिवर्ती-पुस्तकालयों की स्क्रीन के लिए उचित है। छवियों को तब मल्टीपैरामेट्रिक विश्लेषण के लिए संसाधित किया जाता है, जो मेजबान कोशिकाओं के भीतर एमटीबी के रोगजनन पर अनुमानित रूप से पढ़कर प्रदान करता है।
Introduction
पिछले वर्षों के दौरान रिपोर्ट किए गए उभरते और पुनः उभरते संक्रामक रोगजनकों में, माइकोबैक्टीरियम तपेदिक (एमटीबी)2011 (ग्लोबल तपेदिक रिपोर्ट 2012, www.who.int/topics/tuberculosis/en/) में 1.4 मिलियन मौतों और 8.7 मिलियन नए संक्रमणों के लिए जिम्मेदार होने के लिए एक प्रमुख स्थान रखता है। मल्टीड्रग उपचारों की उपलब्धता के बावजूद, संक्रमित लोगों की संख्या अभी भी बढ़ रही है और मल्टीड्रग प्रतिरोधी (एमडीआर) के साथ-साथ बड़े पैमाने पर दवा प्रतिरोधी (एक्सडीआर) एमटीबी जल्दी से दुनिया भर में फैल रहे हैं1। इसके अलावा, जब एमटीबी एंटीजन की उपस्थिति को ध्यान में रखते हुए, यह स्पष्ट है कि वैश्विक आबादी का एक तिहाई एमटीबी द्वारा गुप्त रूप से संक्रमित माना जाता है। सांख्यिकीय रूप से, दस में से एक मामले में, बाद के नैदानिक लक्षणों के साथ रोग के सक्रिय रूप की दिशा में विकास होता है2। इसलिए एमटीबी से लड़ने के लिए नए साधनों की तत्काल जरूरत है । इस संदर्भ में, हमने स्वचालित कॉन्फोकल फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी3द्वारा एमटीबी आक्रमण और मेजबान कोशिकाओं में गुणा की निगरानी पर निर्भर एक इन विट्रो विजुअल फेनोटाइपिक परख विकसित की। स्वचालित छवि अधिग्रहण और विश्लेषण के संयोजन में ३८४-अच्छी तरह से माइक्रोटिटर प्लेटों में परख के अनुकूलन, यौगिकों, siRNAs और जीवाणु म्यूटेंट के मध्यम पैमाने के पुस्तकालयों की उच्च सामग्री/उच्च थ्रूपुट स्क्रीनिंग (HC/HTS) की अनुमति दी । इस फेनोटाइपिक परख पर जीनोम वाइड आरएनएआई पुस्तकालय की स्क्रीनिंग ने इस प्रकार एमटीबी तस्करी और इंट्रासेलुलर प्रतिकृति में शामिल प्रमुख मेजबान कारकों की पहचान को सक्षम किया, लेकिन कंद-कंद बेसिलस द्वारा शोषित मेजबान-रास्तों की स्पष्टता भी। इस विशेष फेनोटाइपिक परख का एक और अनुकूलन एमटीबी इंट्रा-फगोसोमल हठ के लिए आवश्यक जीवाणु कारकों की पहचान के लिए था। उदाहरण के लिए, फागोसोम परिपक्वता की गिरफ्तारी को प्रमुख तंत्रों में से एक माना जाता है जो मैक्रोफेज में एमटीबी के अस्तित्व और प्रतिकृति की सुविधा प्रदान करता है। फ्लोरोसेंटली लेबल-अम्लीय डिब्बों में एमटीबी नॉक आउट म्यूटेंट के उपकोशिक स्थानीयकरण की निगरानी जीवित रहने की प्रक्रिया में शामिल जीवाणु जीन की पहचान के लिए अनुमति दी4। अंत में, एमटीबी की उच्च सामग्री इमेजिंग भी इंट्रासेलुलर बैक्टीरियल ग्रोथ3जैसी विभिन्न घटनाओं को बाधित करने के लिए दवा दक्षता की मात्रा निर्धारित करने के लिए एक उत्कृष्ट विधि प्रदान करती है। कुल मिलाकर, इस प्रकार की उच्च थ्रूपुट फेनोटाइपिक परख टीबी के खिलाफ दवा की खोज को तेज करने की अनुमति देती है और इन विभिन्न दृष्टिकोणों द्वारा एकत्र किए गए डेटा एमटीबीद्वारा लगाए गए मेजबान हेरफेर की बेहतर समझ में योगदान देते हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
हम यहां एक phenotypic परख के लिए आवश्यक तरीकों का वर्णन एक GFP-व्यक्त Mtb H37Rv तनाव का उपयोग करने के लिए फ्लोरोसेंटी लेबल मेजबान कोशिकाओं को संक्रमित है, जो यह उच्च सामग्री के लिए उपयुक्त बनाता है/ इस प्रोटोकॉल को …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम के लिए वित्तीय सहायता यूरोपीय समुदाय (ईआरसी-एसटीजी इंट्रासेल्टबी ग्रांट एन ° 260901, एमएम4बीबी ग्रांट एन ° 260872), एग्नेस नेशनल डी रेचेचे, फेडरर (12001407 (डी-अल) इक्विटेक्स इमेजेक्स इमेजेक्स बायोमेड) और क्षेत्र नोर्ड पास डी कैलैस द्वारा प्रदान की गई थी। हम मंच BICeL से Gaspard Deloison, एलिजाबेथ Werkmeister, एंटोनिनो बोनियोवानी और फ्रैंक Lafont की तकनीकी सहायता को कृतज्ञता से स्वीकार करते हैं ।
Materials
| µclear-plate black, 384 well | Greiner bio-one | 781091 | 127.8/86/15 MM with Lid, TC treated |
| CellCarrier 384 well plate | PerkinElmer | 6007550 | Black, Clear Bottom, with Lid, TC treated |
| V-bottom white , 384 well-plate | Greiner bio-one | 781280 | |
| sealing tape, breathable, sterile | Corning | 3345 | |
| Lipofectamine RNAiMax | Life Technologies | 13778150 | Transfection reagent |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | 34943 | |
| RPMI 1640 + GlutaMAX-I | Life Technologies | 61870-010 | Cell culture medium |
| D-PBS 1X [-]MgCl2/[-]CaCl2 | Life Technologies | 14190-094 | Dulbecco's Phosphate Salin Buffer |
| D-PBS 1X [+]MgCl2/[+]CaCl2 | Life Technologies | 14190-091 | Dulbecco's Phosphate Salin Buffer |
| Fetal bovine serum | Life Technologies | 2610040-79 | |
| FICOLL PAQUE PLUS | DUTSCHER | 17-1440-03 | Ficoll for Peripherical Blood Monocyte Cells purification |
| CD14 MicroBeads, human | Miltenyi | 130-050-201 | Purification of CD14+ Monocytes |
| Human M-CSF, premium gr. (1000 μg) | Miltenyi | 130-096-493 | Macrophage Colony Stimulating Factor |
| LS Columns | Miltenyi | 130-042-401 | Columns for CD14+ Monocytes isolation |
| Tween 80 | Euromedex | 2002-A | Mycobacteria culture |
| Glycerol high purity | Euromedex | 50405-EX | Mycobacteria culture |
| Middlebrook OADC enrichment | Becton-Dickinson | 211886 | Mycobacteria culture |
| 7H9 | Becton-Dickinson | W1701P | Mycobacteria culture |
| Versene 1X | Life Technologies | 15040033 | Non enzymatic cell dissociation solution |
| DAPI | Life Technologies | D1306 | Nuclei dye |
| Hoechst 33342 | Life Technologies | H3570 | Nuclei dye |
| Syto60 | Life Technologies | S11342 | Nuclei/cytoplasm dye |
| Formalin | Sigma-Aldrich | HT5014 | Cell fixation solution |
| siRNA targeting Dectin-1 | Santa-Cruz | sc-63276 | |
| *siGenome* Non targeted siRNA pool | Dharmacon | D-001206-14 | |
| Rifampicin | Sigma-Aldrich | R3501 | antibiotic |
| Isoniazid (INH) | Sigma-Aldrich | I3377-50G | antibiotic |
| Hygromycin B | Life Technologies | 10687-010 | antibiotic |
| Amikacin | Sigma-Aldrich | A1774 | antibiotic |
| Automated Confocal Microscope OPERA | PerkinElmer | Image acquisition | |
| Columbus 2.3.1 Server Database | PerkinElmer | Data transfert, storage and analysis | |
| Acapella 2.6 software | PerkinElmer | Image-based analysis | |
| GraphPad Prism5 software | GraphPad | Statistical analysis | |
| Excel 2010 | Microsoft | Statistical analysis |
References
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