En mikroskopisk fenotypisk analyse for kvantifisering av intracellulær mykobakterier tilpasset høygjennomstrømning / screening av høyt innhold
Summary
Her beskriver vi en fenotypisk analyse som gjelder for høygjennomstrømnings-/høyinnholdsskjermer av småintervenenserende syntetiske RNA (siRNA), kjemisk forbindelse og Mycobacterium tuberkulosemutantbiblioteker. Denne metoden er avhengig av påvisning av fluorescerende merket Mycobacterium tuberculosis innen fluorescerende merket vertscelle ved hjelp av automatisert konfikal mikroskopi.
Abstract
Til tross for tilgjengeligheten av terapi og vaksine, er tuberkulose (TB) fortsatt en av de mest dødelige og utbredte bakterielle infeksjonene i verden. Siden flere tiår er det plutselige utbruddet av multi- og omfattende legemiddelresistente stammer en alvorlig trussel for kontroll av tuberkulose. Derfor er det viktig å identifisere nye mål og veier som er kritiske for tuberkuloseens årsaksmiddel, Mycobacterium tuberkulose (Mtb) og å søke etter nye kjemikalier som kan bli TB-stoffer. En tilnærming er å sette opp metoder som passer for genetiske og kjemiske skjermer av store biblioteker som muliggjør søking av en nål i en høystakk. For dette formål utviklet vi en fenotypisk analyse som er avhengig av påvisning av fluorescerende merket Mtb i fluorescerende merkede vertsceller ved hjelp av automatisert konfokal mikroskopi. Denne in vitro-analysen tillater en bildebasert kvantifisering av koloniseringsprosessen til Mtb i verten og ble optimalisert for 384-brønns mikroplateformat, som er riktig for skjermer av siRNA-, kjemisk forbindelse- eller Mtb mutantbiblioteker. Bildene behandles deretter for multiparametrisk analyse, som gir avlesning på patogenesen av Mtb i vertsceller.
Introduction
Blant de fremvoksende og nye smittsomme patogenene som er rapportert i løpet av de siste årene, har Mycobacterium tuberculosis (Mtb) et fremtredende sted å være ansvarlig for 1,4 millioner dødsfall og 8,7 millioner nye infeksjoner i 2011 (Global tuberculosis report 2012, www.who.int/topics/tuberculosis/en/). Til tross for tilgjengeligheten av multidrug terapier, antall infiserte mennesker er fortsatt på vei opp og multidrug resistente (MDR) samt omfattende narkotikaresistente (XDR) Mtb sprer seg raskt over hele verden1. Videre, når man tar hensyn til tilstedeværelsen av Mtb antigener, er det tydelig at en tredjedel av den globale befolkningen anses å være latent smittet av Mtb. Statistisk sett, i ett tilfelle av ti, er det evolusjon mot den aktive sykdomsformen med påfølgende kliniske symptomer2. Derfor er det nødvendig med nye midler for å bekjempe Mtb. I denne sammenhengen utviklet vi en in vitro visuell fenotypisk analyse som er avhengig av å overvåke Mtb-invasjon og multiplikasjon i vertsceller ved automatisert konfokal fluorescensmikroskopi3. Tilpasningen av analysen i 384-brønns mikrotiterplater i kombinasjon med automatisert bildeanskaffelse og analyse tillot high-content/High-throughput Screening (HC/HTS) av mellomstore biblioteker av forbindelser, siRNAer og bakterielle mutanter. Screeningen av et genom bredt RNAi-bibliotek på denne fenotypiske analysen gjorde det dermed mulig å identifisere de viktigste vertsfaktorene som er involvert i Mtb-trafficking og intracellulær replikasjon, men også belysningen av vertsveier utnyttet av tuberkelbacillusen. En annen tilpasning av denne spesielle fenotypiske analysen var for identifisering av bakteriefaktorer som er avgjørende for Mtb intra-fagocomiell utholdenhet. For eksempel anses arrestasjonen av fagfellemodning som en av de viktigste mekanismene som letter overlevelse og replikering av Mtb i makrofag. Overvåkingen av subcellulær lokalisering av Mtb knock-out mutanter i fluorescerende merket-sure rom tillatt for identifisering av bakterielle gener involvert i overlevelsesprosessen4. Til slutt tilbyr høyinnholdsavbildningen av Mtb også en utmerket metode for å kvantifisere legemiddeleffektivitet for å hemme ulike fenomener som intracellulær bakterievekst3. Til sammen tillater denne typen høy gjennomstrømning fenotypisk analyse akselererende narkotikaoppdagelse mot TB, og dataene som samles inn av disse forskjellige tilnærmingene, bidrar til en bedre forståelse av vertsmanipulasjonen som utøves av Mtb.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi beskriver her metodene som kreves for en fenotypisk analyse ved hjelp av en GFP-uttrykkende Mtb H37Rv-stamme for å infisere fluorescerende merkede vertsceller, noe som gjør det hensiktsmessig for skjermer med høyt innhold / høy gjennomstrømning. Denne protokollen kan brukes på et bredt spekter av forbindelser, fluorescerende sonder og Mtb-mutanter. For hver protokoll som er beskrevet ovenfor, kan fikserings- og immunmerkingstrinn utføres før bildeinnhenting. Vi bruker et automatisert fluoresc…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Økonomisk støtte til dette arbeidet ble gitt av Det europeiske fellesskap (ERC-STG INTRACELLTB Grant n° 260901, MM4TB Grant n° 260872), Agence Nationale de Recherche, Feder (12001407 (D-AL) Equipex Imaginex BioMed) og Regionen Nord Pas de Calais. Vi anerkjenner takknemlig den tekniske hjelpen til Gaspard Deloison, Elizabeth Werkmeister, Antonino Bongiovanni og Frank Lafont fra plattformen BICeL.
Materials
| µclear-plate black, 384 well | Greiner bio-one | 781091 | 127.8/86/15 MM with Lid, TC treated |
| CellCarrier 384 well plate | PerkinElmer | 6007550 | Black, Clear Bottom, with Lid, TC treated |
| V-bottom white , 384 well-plate | Greiner bio-one | 781280 | |
| sealing tape, breathable, sterile | Corning | 3345 | |
| Lipofectamine RNAiMax | Life Technologies | 13778150 | Transfection reagent |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | 34943 | |
| RPMI 1640 + GlutaMAX-I | Life Technologies | 61870-010 | Cell culture medium |
| D-PBS 1X [-]MgCl2/[-]CaCl2 | Life Technologies | 14190-094 | Dulbecco's Phosphate Salin Buffer |
| D-PBS 1X [+]MgCl2/[+]CaCl2 | Life Technologies | 14190-091 | Dulbecco's Phosphate Salin Buffer |
| Fetal bovine serum | Life Technologies | 2610040-79 | |
| FICOLL PAQUE PLUS | DUTSCHER | 17-1440-03 | Ficoll for Peripherical Blood Monocyte Cells purification |
| CD14 MicroBeads, human | Miltenyi | 130-050-201 | Purification of CD14+ Monocytes |
| Human M-CSF, premium gr. (1000 μg) | Miltenyi | 130-096-493 | Macrophage Colony Stimulating Factor |
| LS Columns | Miltenyi | 130-042-401 | Columns for CD14+ Monocytes isolation |
| Tween 80 | Euromedex | 2002-A | Mycobacteria culture |
| Glycerol high purity | Euromedex | 50405-EX | Mycobacteria culture |
| Middlebrook OADC enrichment | Becton-Dickinson | 211886 | Mycobacteria culture |
| 7H9 | Becton-Dickinson | W1701P | Mycobacteria culture |
| Versene 1X | Life Technologies | 15040033 | Non enzymatic cell dissociation solution |
| DAPI | Life Technologies | D1306 | Nuclei dye |
| Hoechst 33342 | Life Technologies | H3570 | Nuclei dye |
| Syto60 | Life Technologies | S11342 | Nuclei/cytoplasm dye |
| Formalin | Sigma-Aldrich | HT5014 | Cell fixation solution |
| siRNA targeting Dectin-1 | Santa-Cruz | sc-63276 | |
| *siGenome* Non targeted siRNA pool | Dharmacon | D-001206-14 | |
| Rifampicin | Sigma-Aldrich | R3501 | antibiotic |
| Isoniazid (INH) | Sigma-Aldrich | I3377-50G | antibiotic |
| Hygromycin B | Life Technologies | 10687-010 | antibiotic |
| Amikacin | Sigma-Aldrich | A1774 | antibiotic |
| Automated Confocal Microscope OPERA | PerkinElmer | Image acquisition | |
| Columbus 2.3.1 Server Database | PerkinElmer | Data transfert, storage and analysis | |
| Acapella 2.6 software | PerkinElmer | Image-based analysis | |
| GraphPad Prism5 software | GraphPad | Statistical analysis | |
| Excel 2010 | Microsoft | Statistical analysis |
References
- Gandhi, N. R., et al. Multidrug-resistant and extensively drug-resistant tuberculosis: a threat to global control of tuberculosis. Lancet. 375, 1830-1843 (2010).
- Barry, C. E., et al. The spectrum of latent tuberculosis: rethinking the biology and intervention strategies. Nat. Rev. Microbiol. 7, 845-855 (2009).
- Christophe, T., Ewann, F., Jeon, H. K., Cechetto, J., Brodin, P. High-content imaging of Mycobacterium tuberculosis-infected macrophages: an in vitro model for tuberculosis drug discovery. Future Med. Chem. 2, 1283-1293 (2010).
- Brodin, P., et al. High content phenotypic cell-based visual screen identifies Mycobacterium tuberculosis acyltrehalose-containing glycolipids involved in phagosome remodeling. PLoS Pathog. 6, (2010).
- Bermudez, L. E., Goodman, J. Mycobacterium tuberculosis invades and replicates within type II alveolar cells. Infect. Immun. 64, 1400-1406 (1996).
- Dobos, K. M., Spotts, E. A., Quinn, F. D., King, C. H. Necrosis of lung epithelial cells during infection with Mycobacterium tuberculosis is preceded by cell permeation. Infect. Immun. 68, 6300-6310 (2000).
- McDonough, K. A., Kress, Y. Cytotoxicity for lung epithelial cells is a virulence-associated phenotype of Mycobacterium tuberculosis. Infect. Immun. 63, 4802-4811 (1995).
- Lee, H. M., Yuk, J. M., Shin, D. M., Jo, E. K. Dectin-1 is inducible and plays an essential role for mycobacteria-induced innate immune responses in airway epithelial cells. J. Clin. Immunol. 29, 795-805 (2009).
- Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. J. Biomol. Screen. 4, 67-73 (1999).
- Birmingham, A., et al. Statistical methods for analysis of high-throughput RNA interference screens. Nat. Methods. 6, 569-575 (2009).
- Carralot, J. P., et al. Automated high-throughput siRNA transfection in raw 264.7 macrophages: a case study for optimization procedure. J. Biomol. Screen. 14, 151-160 (2009).
- Zhang, X. D. Illustration of SSMD, z score, SSMD*, z* score, and t statistic for hit selection in RNAi high-throughput screens. J. Biomol. Screen. 16, 775-785 (2011).
- Song, O. R., et al. Confocal-based method for quantification of diffusion kinetics in microwell plates and its application for identifying a rapid mixing method for high-content/throughput screening. J. Biomol. Screen. 15, 138-147 (2010).
