Dissekering av<em> Xenopus laevis</em> Neural Crest för<em> In vitro</em> Explantation kultur eller<em> In vivo</em> Transplantation
Summary
Detta protokoll beskriver hur man dissekera premigratory cranial neural crest (NC) från Xenopus laevis neurulas. Dessa explants kan pläterade på fibronektin-och odlas in vitro, eller ympas tillbaka in embryon värd. Denna teknik gör det möjligt att studera mekanismerna för NC epitel-till-mesenkym övergång, migration och differentiering.
Abstract
Neurallisten (NC) är en övergående rygg neuralrörsdefekter cellpopulation som genomgår en epitel-till-mesenkym övergång (EMT) i slutet av neurulation, vandrar i stor utsträckning mot olika organ, och skiljer i många typer av derivat (nervceller, glia, brosk och ben, pigmenterade och endokrina celler). I detta protokoll, beskriver vi hur man dissekera premigratory cranial NC från Xenopus laevis embryon, för att studera NC utveckling in vivo och in vitro. Grodan modellen erbjuder många fördelar för att studera tidiga utveckling, rikliga satser finns tillgängliga, embryon utvecklas snabbt, in vivo-vinst och förlust av funktionsstrategier tillåter manipulering av genuttryck före NC dissektion i donator och / eller embryon värd. NC explants kan pläterade på fibronektin och som används för in vitro-studier. De kan odlas i flera dagar i ett serumfritt definierat medium. Vi beskriver också hur man ympa NC explants tillbakai värd embryon för att studera NC migration och differentiering in vivo.
Introduction
Neurallisten (NC) är en övergående embryonal cellpopulation som framträder i neuralröret i slutet av neurulation i ryggradsdjur embryon. Signalering och genetiska händelser som styr NC specifikation börja så tidigt som gastrulation. NC specificeras vid gränsen mellan neurala och icke-neural ektoderm av signaler från omgivande rygg vävnader. Vid slutet av neurulation, NC celler genomgår ett epitel till mesenkym övergång (EMT) och migrera i stor utsträckning i embryot följande stereotypa rutter genom att svara på omgivande vägledande cues. När de har nått sin slutdestination, de differentieras till ett brett spektrum av derivat, t.ex. nervceller, glia, ben, brosk och pigmenterade celler 1-5. På grund av deras bidrag till många celltyper och embryonala vävnader, defekter vid varje steg av NC-celler utveckling, från induktion till slutlig differentiering, kan orsaka medfödda syndrom heter neurocristopathies 6. Experimental manipulation av utvecklings NC i olika skeden – specifikationer, EMT, migration och differentiering – kommer att öka vår förståelse av neurocristopathies och möjliggöra utformning av potentiella terapeutiska strategier.
Xenopus laevis embryot är en modell av val att studera NC-utveckling. Ett stort antal embryon är lätt att få, och yttre befruktning ger tillgång till de allra första stegen i utvecklingen. Många verktyg finns tillgängliga för att experimentellt manipulera X. laevis embryonala utvecklingen. Gene vinst-av-funktion och knockdown är lätta att utföra genom microinjecting enskilda celler i tidiga blastulas. Embryonala vävnader kan klippas för in vitro-återförening 7-11 eller back-ympning analyser 12,13.
I detta protokoll, beskriver vi hur man dissekera ut premigratory cranial NC i X. laevis sena neurulas, före migreringen. Dessa explantat kan odlas på fibronektin-coated plattor för att studera migration och differentiering i kontrollerad in vitro experimentella förhållanden. NC explants kan även ympas in i normala eller manipulerade värd embryon för att studera deras migration och differentiering in vivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Detta protokoll beskriver en enkel teknik för att explantera premigratory cranial NC i X. laevis embryon. De embryon som används för sådana experiment måste vara robust och läker bra. Kassera parti ohälsosamma embryon. Dessutom växer embryon vid olika temperaturer (från 12 till 18 till 20 ° C), i syfte att skära ut neurallisten vid steget 17 och inte senare. Efter etapp 17, kan neurallist blandas med KRANIE mesoderm och kan inte tas bort helt och hållet. Xenopus vävnader läker snabbt och …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna tackar Adeline Dolly för bilderna av Explantation på fibronektin, Eric Theveneau för hjälp diskussioner och Animal Facility av Institut Curie. CM är en forskarassistent i regionen Ile de France (Domaine d'Interet Majeur Stem Pole), Université Paris Sud (Attache Temporaire d'Enseignement et de Recherche), och Agence Nationale de la Recherche. Detta arbete har finansierats av Université Paris Sud (Attractivite 2011), Centre National de la Recherche Scientifique (Action Thematique et Incitative sur Programme), Association pour la Recherche contre le Cancer Grant SFI20101201882, Ligue contre le Cancer, och Agence Nationale de la Recherche (Agence Nationale de la Recherche Programme Blanc).
Materials
| Fibronectin from bovine plasma | Sigma | F4759-1MG | |
| Bovine Serum Albumine. Fraction V | Euromedex | 04-100-811-C | Lower quality grade may be suitable for this application |
| Stainless Steel Insect Pins. Size 000 | FST | 26001 | |
| Dumont #5 forceps 0.05 mm x 0.02 mm | FST | 11252-20 |
References
- Sauka-Spengler, T., Bronner-Fraser, M. A gene regulatory network orchestrates neural crest formation. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 9 (7), 557-568 (2008).
- Theveneau, E., Mayor, R. Neural crest delamination and migration: from epithelium-to-mesenchyme transition to collective cell migration. Dev. Biol. 366 (1), 34-54 (2012).
- Stuhlmiller, T. J., García-Castro, M. I. Current perspectives of the signaling pathways directing neural crest induction. Cell. Mol. Life Sci. 69 (22), 3715-3737 (2012).
- Milet, C., Monsoro-Burq, A. H. Neural crest induction at the neural plate border in vertebrates. Dev. Biol. 366 (1), 22-33 (2012).
- Pegoraro, C., Monsoro-Burq, A. H. Signaling and transcriptional regulation in neural crest specification and migration: lessons from Xenopus embryos. Dev. Biol. 2 (2), 247-259 (2013).
- Etchevers, H. C., Amiel, J., Lyonnet, S. Molecular Bases of Human Neurocristopathies. Neural Crest Induct. Different. 589, 213-234 (2005).
- Nieuwkoop, P. D., et al. Activation and organization of the central nervous system in amphibians. Part II. Differentiation and organization. J. Exp. Zool. 120 (1), 33-81 (1952).
- Nieuwkoop, P. D., et al. Activation and organization of the central nervous system in amphibians Part I. Induction and activation. J. Exp. Zool. 120 (1), 1-31 (1952).
- Sharpe, C. R., Fritz, A., De Robertis, E. M., Gurdon, J. B. A homeobox-containing marker of posterior neural differentiation shows the importance of predetermination in neural induction. Cell. 50 (5), 749-758 (1987).
- Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. . Early development of Xenopus laevis: a laboratory manual. , (2000).
- Monsoro-Burq, A. -. H., Fletcher, R. B., Harland, R. M. Neural crest induction by paraxial mesoderm in Xenopus embryos requires FGF signals. Development. 130 (14), 3111-3124 (2003).
- Milet, C., Maczkowiak, F., Roche, D. D., Monsoro-Burq, A. H. Pax3 and Zic1 drive induction and differentiation of multipotent, migratory, and functional neural crest in Xenopus embryos. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110 (14), 5528-5533 (2013).
- Sadaghiani, B., Thiébaud, C. H. Neural crest development in the Xenopus laevis embryo, studied by interspecific transplantation and scanning electron microscopy. Dev. Biol. 124 (1), 91-110 (1987).
- Theveneau, E., et al. Collective chemotaxis requires contact-dependent cell polarity. Dev. Cell. 19 (1), 39-53 (2010).
- Slack, J. M., Forman, D. An interaction between dorsal and ventral regions of the marginal zone in early amphibian embryos. J. Embryol. Exp. Morphol. 56, 283-299 (1980).
- Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Embryo dissection and micromanipulation tools. CSH Protoc. , (2007).
- Nieuwkoop, P. D., Faber, J. Normal table of Xenopus laevis (Daudin): a systematical and chronological survey of the development from the fertilized egg till the end of metamorphosis. , (1994).
- Theveneau, E., Mayor, R. Beads on the run: beads as alternative tools for chemotaxis assays. Methods Mol. Biol. 769, 449-460 (2011).
- Bronner, M. E., LeDouarin, N. M. Development and evolution of the neural crest: An overview. Dev. Biol. 366 (1), 2-9 (2012).
- Alfandari, D., Cousin, H., Gaultier, A., Hoffstrom, B. G., DeSimone, D. W. Integrin α5β1 supports the migration of Xenopus cranial neural crest on fibronectin. Dev. Biol. 260 (2), 449-464 (2003).
- Fort, P., et al. Activity of the RhoU/Wrch1 GTPase is critical for cranial neural crest cell migration. Dev. Biol. 350 (2), 451-463 (2011).
- Matthews, H. K., et al. Directional migration of neural crest cells in vivo is regulated by Syndecan-4/Rac1 and non-canonical Wnt signaling/RhoA. Development. 135 (10), 1771-1780 (2008).
- Kashef, J., Köhler, A., Kuriyama, S., Alfandari, D., Mayor, R., Wedlich, D. Cadherin-11 regulates protrusive activity in Xenopus cranial neural crest cells upstream of Trio and the small GTPases. Genes Dev. 23 (12), 1393-1398 (2009).
- Hwang, Y. -. S., Luo, T., Xu, Y., Sargent, T. D. Myosin-X is required for cranial neural crest cell migration in Xenopus laevis. Dev. Dyn. 238 (10), 2522-2529 (2009).
- Lee, G., et al. Modelling pathogenesis and treatment of familial dysautonomia using patient-specific iPSCs. Nature. 461 (7262), 402-406 (2009).
- Mica, Y., Lee, G., Chambers, S. M., Tomishima, M. J., Studer, L. Modeling Neural Crest Induction, Melanocyte Specification, and Disease-Related Pigmentation Defects in hESCs and Patient-Specific iPSCs.. Cell Reports. 3 (4), 1140-1152 (2013).
- Shnitsar, I., Borchers, A. PTK7 recruits dsh to regulate neural crest migration. Development. 135 (24), 4015-4024 (2008).
- Matthews, H. K., et al. Directional migration of neural crest cells in vivo is regulated by Syndecan-4/Rac1 and non-canonical Wnt signaling/RhoA. Development. 135 (10), 1771-1780 (2008).
- Matthews, H. K., Broders-Bondon, F., Thiery, J. P., Mayor, R. Wnt11r is required for cranial neural crest migration. Dev. Dyn. 237 (11), 3404-3409 (2008).
- Carmona-Fontaine, C., et al. Contact inhibition of locomotion in vivo controls neural crest directional migration. Nature. 456 (7224), 957-961 (2008).
- Guiral, E. C., Faas, L., Pownall, M. E. Neural crest migration requires the activity of the extracellular sulphatases XtSulf1 and XtSulf2. Dev. Biol. 341 (2), 375-388 (2010).
- Cousin, H., Abbruzzese, G., Kerdavid, E., Gaultier, A., Alfandari, D. Translocation of the Cytoplasmic Domain of ADAM13 to the Nucleus Is Essential for Calpain8-a Expression and Cranial Neural Crest Cell Migration. Dev. Cell. 20 (2), 256-263 (2011).
- Borchers, A., David, R., Wedlich, D. Xenopus cadherin-11 restrains cranial neural crest migration and influences neural crest specification. Development. 128 (16), 3049-3060 (2001).
- Borchers, A., Epperlein, H. -. H., Wedlich, D. An assay system to study migratory behavior of cranial neural crest cells in Xenopus. Dev. Genes Evol. 210 (4), 217-222 (2000).
- Kerney, R., Gross, J. B., Hanken, J. Runx2 is essential for larval hyobranchial cartilage formation in Xenopus laevis. Dev. Dyn. 236 (6), 1650-1662 (2007).
- Yan, C. Y. I., Skourides, P., Chang, C., Samba Brivanlou, A. a Xenopus hnRNP expressed in neural and neural crest tissues. Dev. Dyn. 238 (1), 204-209 (2009).
- Acloque, H., Adams, M. S., Fishwick, K., Bronner-Fraser, M., Nieto, M. A. Epithelial-mesenchymal transitions: the importance of changing cell state in development and disease. J. Clin. Invest. 119 (6), 1438-1449 (2009).
