باستخدام نيون البروتينات إلى تصور وQuantitate<em> الكلاميديا</em> فجوة النمو حيوية في الخلايا الحية
Summary
A live cell fluorescent protein based method for illuminating cellular vacuoles (inclusions) containing Chlamydia is described. This strategy enables rapid, automated determination of Chlamydia infectivity in samples and can be used to quantitatively investigate inclusion growth dynamics.
Abstract
The obligate intracellular bacterium Chlamydia elicits a great burden on global public health. C. trachomatis is the leading bacterial cause of sexually transmitted infection and also the primary cause of preventable blindness in the world. An essential determinant for successful infection of host cells by Chlamydia is the bacterium’s ability to manipulate host cell signaling from within a novel, vacuolar compartment called the inclusion. From within the inclusion, Chlamydia acquire nutrients required for their 2-3 day developmental growth, and they additionally secrete a panel of effector proteins onto the cytosolic face of the vacuole membrane and into the host cytosol. Gaps in our understanding of Chlamydia biology, however, present significant challenges for visualizing and analyzing this intracellular compartment. Recently, a reverse-imaging strategy for visualizing the inclusion using GFP expressing host cells was described. This approach rationally exploits the intrinsic impermeability of the inclusion membrane to large molecules such as GFP. In this work, we describe how GFP- or mCherry-expressing host cells are generated for subsequent visualization of chlamydial inclusions. Furthermore, this method is shown to effectively substitute for costly antibody-based enumeration methods, can be used in tandem with other fluorescent labels, such as GFP-expressing Chlamydia, and can be exploited to derive key quantitative data about inclusion membrane growth from a range of Chlamydia species and strains.
Introduction
الأمراض المعدية التي تسببها أنواع من البكتيريا المتدثرة الخلايا تثير عبئا كبيرا على الصحة العالمية، بما في ذلك الأمراض المنقولة جنسيا ومرض التهاب الحوض، والعمى، والالتهاب الرئوي، وربما تصلب الشرايين 1-4. قدرة الكلاميديا للتفاعل مع الخلية المضيفة، من خلال فجوة (وهو ما يسمى إدراج)، هو عامل حاسم للعدوى الناجح للخلايا والمضيف. إدراج هو حجرة المسببة للأمراض الجديدة التي تمكن النمو الناجمة عن المتدثرة ويتم تعديل حيوي طوال دورة كاملة 2-3 يوم التنموية المتدثرة 5. طبيعة الخلايا تلزم من الكلاميديا تقدم العديد من التحديات للمجتمع العلمي، ولا سيما لدراسة مباشرة بيولوجيا الفريد للإدراج. وثمة عائقا كبيرا في عدم القدرة على تصور بكفاءة إما الكلاميديا داخل الخلايا أو إدراجها من قبل نهج الفلورسنتوفاق في الخلايا الحية. وقد كشفت الاكتشاف الأخير أخيرا وسيلة لتوليد GFP معربا عن C. الحثرية 6؛ ومع ذلك، لم يؤد هذا الاستنتاج بعد أن وضع العلامات المحددة لإدراج. وقد وصفت بعض التقنيات لوضع العلامات من البكتيريا والادراج 7،8، لكنها تعاني من قصور مثل عدم التحديد، transiency والقابلية للphotobleaching من. A اكتشاف رئيسي من قبل مجموعتنا إنشاء استراتيجية جديدة لإلقاء الضوء على إدراج باستخدام GFP معربا عن الخلايا المضيفة 9. هذه الاستراتيجية يستغل بعقلانية الكتامة الجوهرية للغشاء إدراج جزيئات أكبر من 520 دا 10. عندما صممت الخلايا للتعبير ثابت معين بروتين فلوري عصاري خلوي (على سبيل المثال، أو GFP mCherry)، شوائب الكلاميديا واضحة مع وضوح ملحوظا من قبل استبعادهم كاملة من مضان. هذه الاستراتيجية التصوير العكسي تمكن التصور فوري من الادراج لجميع كلوروفيلالأنواع amydia ويمكن تكييفه بسهولة لمعظم الخلايا المضيفة من الفائدة. كدليل على فائدتها، وقد استخدمت هذه الطريقة سابقا للكشف وتحديد مسارات الخروج الخلوية لالكلاميديا النيابة 9.
هنا، علينا أن نظهر كذلك كيف يتم تنفيذ هذه الطريقة، ويمكن استغلاله لاستخلاص البيانات الكمية الرئيسية حول ديناميات النمو إدراج. وعلاوة على ذلك، فإنه يمكن أن تحل محل فعال للطرق التعداد القائم على الضد مكلفة، ويمكن استخدامها جنبا إلى جنب مع العلامات الفلورية الأخرى، مثل mKate2، معربا عن الكلاميديا 11. هذه تركيبة قوية من الأدوات تتيح استكشاف الخصائص الفيزيائية للغشاء إدراج المتدثرة داخل الخلايا الحية المضيفة.
Protocol
Representative Results
Discussion
نحن هنا تصف استراتيجية تجريبية لتوليد الخلايا المضيفة الفلورسنت التصور في الوقت الحقيقي وتحليل الادراج الكلاميديا. هذا النهج فجوة التصور يمنح القدرة القوية لإلقاء الضوء، تتبع وكميا قياس الخصائص الديناميكية للشوائب المتدثرة عبر السكان من الخلايا أو في زنازين …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank Ian Clarke and P. Scott Hefty for the pGFP-SW2 and pASK-GFP-mKate2-L2 plasmids, respectively. We thank Paul Miller for technical assistance and Richard Stephens for other resources. This work was funded by NIH grant AI095603 (KH).
Materials
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668 | |
| Opti-Mem | Invitrogen | 31985 | |
| Polybrene | Sigma | H9268 | |
| 0.45 µm filters | Fisher | 09-719D | |
| G418 | Invitrogen | 10131 | |
| HBSS | Invitrogen | 14025 | |
| DMEM | Invitrogen | 11995 | |
| RPMI 1640 | Invitrogen | 11875 | |
| RPMI 1640 w/o phenol red | Cellgro | 17-105-CV | |
| Penicillin G | Sigma | 13752 | |
| Cycloheximide | Sigma | C7698 | |
| Glass bottom dishes | MatTek | P35G-1.5-14-C | |
| Chamber slides, Lab-Tek II | Nunc | 154526, 154534 |
References
- Stamm, W. E. Chlamydia trachomatis infections: progress and problems. The Journal of Infectious Diseases. 179, S380-S383 (1999).
- Schachter, J., Stephens, R. S. Infection and disease epidemiology. Chlamydia: Intracellular Biology, Pathogenesis, and Immunity. , 139-169 (1999).
- Campbell, L. A., Kuo, C. C. Chlamydia pneumoniae–an infectious risk factor for atherosclerosis. Nature Reviews Microbiology. 2 (1), 23-32 (2004).
- Darville, T., Hiltke, T. J. Pathogenesis of genital tract disease due to Chlamydia trachomatis. The Journal of Infectious Diseases. 201, S114-S125 (2010).
- Hackstadt, T., Stephens, R. S. Cell biology. Chlamydia: Intracellular Biology, Pathogenesis, and Immunity. , 101-138 (1999).
- Wang, Y., Kahane, S., Cutcliffe, L. T., Skilton, R. J., Lambden, P. R., Clarke, I. N. Development of a transformation system for Chlamydia trachomatis: restoration of glycogen biosynthesis by acquisition of a plasmid shuttle vector). PLoS Pathogens. 7 (9), e1002258 (2011).
- Hackstadt, T., Scidmore, M. A., Rockey, D. D. Lipid metabolism in Chlamydia trachomatis-infected cells: directed trafficking of Golgi-derived sphingolipids to the chlamydial inclusion. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (11), 4877-4881 (1995).
- Boleti, H., Ojcius, D. M., Dautry-Varsat, A. Fluorescent labelling of intracellular bacteria in living host cells. Journal of Microbiological Methods. 40 (3), 265-274 (2000).
- Hybiske, K., Stephens, R. S. Mechanisms of host cell exit by the intracellular bacterium Chlamydia. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (27), 11430-11435 (2007).
- Heinzen, R. A., Hackstadt, T. The Chlamydia trachomatis parasitophorous vacuolar membrane is not passively permeable to low-molecular-weight compounds. Infection and Immunity. 65 (3), 1088-1094 (1997).
- Wickstrum, J., Sammons, L. R., Restivo, K. N., Hefty, P. S. Conditional gene expression in Chlamydia trachomatis using the tet system. PLoS One. 8 (10), 10-1371 (2013).
- Chin, E., Kirker, K., Zuck, M., James, G., Hybiske, K. Actin recruitment to the Chlamydia inclusion is spatiotemporally regulated by a mechanism that requires host and bacterial factors. PLoS One. 7 (10), e46949 (2012).
- Agaisse, H., Derré, I. A C. trachomatis cloning vector and the generation of C. trachomatis strains expressing fluorescent proteins under the control of a C. trachomatis promoter. PLoS One. 8 (2), e57090 (2013).
