Introduction
Las enfermedades infecciosas causadas por especies de la bacteria Chlamydia intracelular provocan una carga importante en la salud global, incluyendo enfermedades de transmisión sexual, enfermedad inflamatoria pélvica, la ceguera, neumonía y posiblemente aterosclerosis 1.4. La capacidad de Chlamydia para interactuar con la célula huésped, desde dentro de una vacuola (denominada la inclusión), es un determinante crítico para su éxito de la infección de las células y el anfitrión. La inclusión es una novela compartimento patógeno que permite el crecimiento por clamidias y se modifica dinámicamente durante todo el ciclo de desarrollo de 2-3 días de Chlamydia 5. La naturaleza intracelular obligado de clamidias presenta numerosos retos para la comunidad de investigación, en particular para estudiar directamente de la biología única de la inclusión. Un obstáculo importante ha sido la incapacidad de visualizar de manera eficiente ya sea Chlamydia intracelular o su inclusión por el enfoque fluorescenteES en células vivas. Un descubrimiento reciente ha revelado por fin los medios para generar GFP expresando C. trachomatis 6; Sin embargo, este hallazgo aún no ha dado lugar a un etiquetado específico de la inclusión. Algunas técnicas se han descrito para el etiquetado de las bacterias y las inclusiones 7,8, pero adolecen de deficiencias tales como la no especificidad, la transitoriedad y la susceptibilidad a photobleaching. Un descubrimiento clave de nuestro grupo estableció una nueva estrategia para la iluminación de la inclusión mediante las buenas prácticas agrarias que expresan las células anfitrionas 9. Esta estrategia explota racionalmente la impermeabilidad intrínseca de la inclusión de membrana a las moléculas de mayor que 520 Da 10. Cuando las células están diseñados para expresar de forma estable una proteína fluorescente citosólica particular (por ejemplo, las buenas prácticas agrarias o mCherry), inclusiones de Chlamydia son visibles con notable claridad por su exclusión completa de fluorescencia. Esta estrategia de inversión de imágenes permite la visualización inmediata de inclusiones para todos Chlespecies amydia y que se pueden adaptar fácilmente para la mayoría de las células huésped de interés. Como demostración de su utilidad, este método fue utilizado anteriormente para revelar y definir las vías de salida celulares para Chlamydia spp 9.
Aquí, una vez más demostrar cómo se realiza este procedimiento, y puede ser explotado para obtener datos cuantitativos clave acerca de la dinámica de crecimiento de inclusión. Además, se puede sustituir con eficacia de costosos métodos de enumeración basadas en anticuerpos y se puede utilizar en conjunto con otras etiquetas fluorescentes, tales como mKate2-expresión de Chlamydia 11. Esta poderosa combinación de herramientas permite la exploración de las propiedades físicas de la membrana inclusión clamidia dentro de las células anfitrionas de estar.
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Protocol
1. Generación de host fluorescente Líneas Celulares
- Día 1. Las células 293T Plate (u otra línea de envasado retroviral) en placas de 6 pocillos a 2 x 10 6 células / Bueno, para ser ~ 75% confluentes al día siguiente. Si se desea, la placa de pocillos duplicados para cada uno de retrovirus a utilizar.
- Día 2. células Aspirar y añadir 2 ml de medio de cultivo fresco (DMEM + 10% FBS + 2 mM L-glutamina). Transfectar células con 5-8 g cada uno de vector retroviral (que contiene GFP) y envasado vector (por ejemplo., PVSVg) usando Lipofectamine 2000 o reactivo similar y siguiendo las instrucciones del fabricante.
- Se incuban las células con el ADN durante 4-6 horas en un incubador de CO2 C 37 °, y posteriormente sustituir medio con medio de crecimiento 1 ml.
- Se incuban las células durante 48 horas en 37 ° C incubadora de CO 2.
- Día de las células 3. Placa de destino (por ejemplo., HeLa) en placas de 6 pocillos a una densidad aproximada de 10 5 células / pocillo, para ser ~ 50% de confluencia deldía siguiente. Verificar la transfección positiva en células 293T mediante el control de la fluorescencia de GFP en un microscopio invertido.
- Día 4. Recoger sobrenadantes fuera de las células 293T con una pipeta y filtrar el sobrenadante a través de un filtro de jeringa de acetato de 0,45 micras de celulosa que contienen retrovirus.
- Retire medio a partir de células HeLa y añadir medio de crecimiento de 0,5 ml contiene 16 mg / ml de polibreno. Añadir ~ 0,5 ml de retrovirus filtrada a las células gota a gota e incubar las células en una incubadora de CO 2 C 37 ° durante 24 horas. Almacenar cualquier retrovirus restantes (es decir, desde el duplicar pocillo) a 4 ° C.
- Día 5. Si se hicieron pocillos duplicados para generar retrovirus adicional, repita el paso 1.7 para infectar serie con las partículas retrovirales restantes.
- Día 6. Passage células HeLa transfectadas 1: 1 en una placa de 10 cm que contiene la selección de antibióticos (por ejemplo, 500 mg / ml de neomicina).
- Espere el tiempo suficiente para que las células transducidas a crecer de nuevo en presencia de la selección antibiotic, después de lo cual las células se pueden propagar mediante técnicas estándar con una concentración más baja de antibiótico de selección (por ejemplo., 200 mg / ml de neomicina).
Nota: Las células también se pueden seleccionar clonalmente para el brillo ideales en este momento, si es necesario.
2. Generación de GFP-expresión de Chlamydia trachomatis
- Preparar 2x CaCl 2 tampón (20 mM Tris pH 7,4, 100 mM CaCl 2) y tampón 4SP (0,4 M sacarosa, 16 mM Na 2 HPO 4).
- Día 1. Descongele congelada C. trachomatis disponible el hielo e inmediatamente diluir 10 l bacterias en 50 l 2x CaCl tampón 2. Añadir 3 ADN plásmido mg (por ejemplo., PASK-GFP-mKate2-L2), mezclar bien e incubar durante 30 minutos a 25 ° C.
- Durante este paso, preparar células huésped mediante tripsinización un matraz T-75 de células McCoy en un tubo de centrífuga. Centrifugar la suspensión celular a 50 xg durante 5 min y descartar el sobrenadante. Resuspend celular pellet en volumen apropiado de tampón 1x CaCl 2 para dar una concentración final de 4 x 10 7 células / ml.
- Después de la incubación de 30 min (de la etapa 2.2), añadir 100 l preparados células McCoy para tubo de mezcla de transformación (volumen total 200 l) y se incuba un 20 min adicionales a 25 ° C. Añadir 100 l de esta mezcla de células transformadas a un solo pocillo de una placa de 6 pocillos y superposición con medio 2 ml crecimiento. Incubar a 37 ° C en una incubadora de CO 2 durante 2 días.
- Día 3. células Lyse McCoy infectadas con C. trachomatis mediante la sustitución de medio con 1 ml de dH 2 O y raspado de células con una punta de pipeta de 1.000 l doblada. Añadir 1 ml de tampón 4SP y pasar la suspensión a través de una aguja de 27,5 G ~ 5 veces para la lisis celular eficiente y liberación de C. trachomatis.
- Transferencia de 2 ml del lisado celular que contiene C. trachomatis a un matraz T-75 que contiene una monocapa confluente de recién chapado McCcélulas oy; añadir 8 ml de DMEM (sin FBS) y se incuba durante 2 horas a 25 ° C para permitir C. trachomatis a que se adhieran a las células.
- Células Aspirar y añadir medio de crecimiento fresco suplementado con 10 U / ml de penicilina G y 1 mg / ml de cicloheximida. Incubar matraz durante 48 h en una incubadora de 37 ° C CO 2.
- Día 4. Verifique por microscopía de luz que las células están infectadas y inclusiones contienen Chlamydia aberrante. Identificar inclusiones como vacuolas brillantes en un microscopio óptico estándar, y los organismos de Chlamydia aberrantes como objetos de anillo dentro de inclusiones que son mayores de 2 m de diámetro.
- Día 5. cultura Lyse reemplazando medio con 2 ml dH2O y raspar las células en una suspensión. Añadir 2 ml de tampón 4SP y pasar la suspensión a través de una aguja de 27,5 G ~ 5 veces.
- Utilice 2 ml de lisado de células para infectar una monocapa fresca de células McCoy en un solo pocillo en una placa de 6 pocillos. Se incuban las células con lisado durante 2 horas a 25 ° C, y añadir aspirado de crecimiento frescomedio que contiene penicilina G y cicloheximida.
- Se incuban las células en una incubadora a 37 ° C CO 2 durante 3-5 días, dependiendo de la salud general de las células.
- Repita los pasos 2.9-2.10 una o más veces, según sea necesario, culturas pases en pozos frescas en una placa de 6 pocillos hasta inclusiones buscan normales (desprovistos de cuerpos aberrantes) han surgido. En este momento utilizar un microscopio de fluorescencia invertida para comprobar que C. trachomatis expresar mKate2 (rojo).
- Ampliar los cultivos infectados para la generación de las poblaciones de clamidias alto título, por ejemplo, mediante la recolección de transformantes Chlamydia de células McCoy o HeLa infectadas cultivadas en matraces T-150.
3. La infección de células con Chlamydia
- Placa células GFP-HeLa en recipiente de cultivo deseada, por ejemplo, platos de vidrio de fondo o la cámara de diapositivas de imágenes de alta resolución, o placas de 24 pocillos para la determinación IFU y la detección de múltiples pocillos.
- Descongele frotubo de zen que contiene C. trachomatis, C. muridarum, o C. pneumoniae en hielo y diluido en HBSS a la multiplicidad deseada de infección (MOI), por ejemplo MOI = 1.
- Realizar infecciones ya sea estáticas o centrifugación asistido basado en la cepa particular Chlamydia que se utilizará.
- Para las infecciones con C. trachomatis LGV serovar L2 o C. muridarum, lavar las células GFP-HeLa con HBSS y se incuba con bacterias diluidas durante 2 horas a 25 ° C. Aspirar y lavar las células con HBSS, e incubar las células en medio de crecimiento en 37 ° C incubadora de CO 2.
- Para las infecciones con C. trachomatis serovar D o C. pneumoniae, lavar las células GFP-HeLa con HBSS y añadir bacterias diluidas a las células. Coloque la placa de múltiples pocillos o plato de fondo de cristal (garantizado por la cinta en una tapa de placa de múltiples pocillos) en un soporte de la placa de múltiples pocillos de un accesorio de rotor basculante en una centrífuga de mesa.
- Células centrifugar a 900 xg a 25 ° C durante 1 hora. Retire recipientes de cultivo de centrífuga y el lugar en una incubadora a 37 ° C CO 2 durante 1 hora.
- Aspirar las células en un gabinete de bioseguridad, se lavan las células dos veces con HBSS, y añadir medio de cultivo fresco. Coloque las células en un incubador de CO2 C 37 °.
4. Visualización de células vivas de Chlamydia Inclusiones
- Retire Chlamydia infectadas células GFP-HeLa de CO 2 incubadora y reemplazar medio con RPMI sin rojo fenol + 5% de SFB.
- Células de montaje en un microscopio de fluorescencia invertido (Nikon Eclipse Ti-E o similar) usando un objetivo 20X o superior petróleo.
- El uso de software de imagen (Volocity 6 o similar), se centran en identificar y clamidia infecta células GFP-HeLa: células verdes que contienen grandes agujeros negros (inclusiones de Chlamydia).
- Marque las ubicaciones xyz de las regiones que contienen las células infectadas por clamidia de interés utilizando software de imagen (Volocity 6 o similar). Realizar esto manualmente "Añadir puntos ', mientras que en el modo de vista XY escenario. De esta manera, las coordenadas xyz se guardan para cada ubicación marcada.
- En el cuadro de diálogo Configuración de Adquisición, configurar el software para adquirir verde (GFP, HeLa citosol) y rojo (mKate2, C. trachomatis) canales, ya una tasa de nuevos cuadros por canal cada 5 min.
- Adquirir la secuencia de imágenes mediante la adquisición de protocolo entró anterior haciendo clic en el botón "Capture / Record".
5. La cuantificación de los parámetros de crecimiento de inclusión en células vivas
- En tiempos deseados después de la infección (por ejemplo., 24, 48 hpi) eliminar clamidia infecta células GFP-HeLa de la incubadora y montar en un microscopio de fluorescencia invertida. Nota: Un objetivo 20X o 40X aire con un alto NA es más adecuado para las placas de 24 pocillos, y se recomienda un objetivo de aceite de 40X para la cámara de diapositivas. Crecer células a cada sustrato para este culoay.
- Concéntrese en planos medios de las células, donde las inclusiones están en su diámetro máximo y producir bordes nítidos.
- Adquirir imágenes de muchos campos en cada pocillo (por lo menos 10 por pocillo); pozos normalmente representan réplicas o variables experimentales.
- Enumerar el número de inclusiones de forma manual, por el ojo (inclusiones son compartimentos negros en células GFP-HeLa) o utilizar algoritmos de software de formación de imágenes para identificar y contar automáticamente las inclusiones.
- Encuentra células GFP-HeLa por la intensidad de fluorescencia ('Encuentra Objetos' comando) y ajustar la intensidad umbral de fluorescencia basada en intensidades relativas de las células.
- Filtrar objetos seleccionados utilizando directrices de tamaño de mantener sólo aquellos mayores de 5 micras 2. Se trata de 'población 1'.
- Aplicar 'Rellenar agujeros en objetos' comando utilizando 'población 1' como entrada. Este paso genera 'población 2'.
- Reste 'población 1' de 'población 2 'para dar marcó positivamente inclusiones de Chlamydia, designados como "población 3'.
- Aplicar filtro de tamaño de "población 3 '(comando' Filtro Población '), por ejemplo, los objetos de mantenimiento mayor que 25 m 2 para inclusiones en células infectadas durante 24 horas o más. Para tiempos de infección temprana, como antes de la 18 horas, filtro de tamaño ajustado para mantener los objetos de más de 4 m 2, ya que estas inclusiones son mucho más pequeños. Resultados de filtrado Tamaño de una población de objetos designados como "inclusiones".
- Calcular datos cuantitativos a partir de imágenes, por ejemplo, número de la inclusión, el tamaño de la inclusión, y la circunferencia de la inclusión, utilizando software de imágenes.
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Representative Results
Las células de mamífero que expresan proteínas fluorescentes citosólicas (por ejemplo, GFP) pueden ser diseñados para permitir la iluminación de inclusiones de Chlamydia en cultivos de células en vivo, infectados. Tras la infección con Chlamydia, las inclusiones son fácilmente visibles como puntos negros en las células huésped (Figura 1). La claridad de las inclusiones de fluorescencia de carecer puede ser explotado para la identificación automática de las inclusiones a través de numerosos campos de visión y / o tratamientos (Figura 1). Una vez que las células huésped fluorescentes se han generado, una nueva y potente flujo de trabajo está habilitada para un rápido análisis, cuantitativo de los niveles de infección por clamidia en las muestras experimentales. Una aplicación importante es la determinación de formar inclusión unidades clamidia (IFU) en células vivas, infectados (Figura 2). Esta estrategia experimental obvia la necesidad de procedimientos de inmunofluorescencia que se utilizan rutinariamente en el campo, que son a la vez tiempo ycostoso.
Otra característica clave del enfoque de imágenes descrito es que puede aplicarse fácilmente a cualquier especie de clamidia o cepa, y, además, puede ser explotada para la derivación de importantes características biológicas de inclusiones clamidias. Como ejemplo, un análisis de curso temporal de células GFP-HeLa infectadas con C. trachomatis LGV serovar L2, C. trachomatis serovar D, C. muridarum, y C. pneumoniae se realizó a los 16, 24 y 48 hpi (Figura 3). Para cada una de estas especies de Chlamydia y cepas, las inclusiones se marcaron y se analizaron para calcular su área promedio, el perímetro de longitud, y el número por célula en los tiempos indicados (Figura 4). Estos atributos proporcionan información importante acerca de la biología de las inclusiones clamidias e informar a la forma en que interactúan con la célula huésped. El método descrito proporciona un enfoque simplista para acceder a esta información de una manera que su rpasses lo que puede lograrse mediante otras técnicas experimentales. Una utilidad final de la estrategia de etiquetado inverso es para imágenes en tiempo real de inclusiones de Chlamydia en las células vivas. Un ejemplo de esto se muestra en la película 1.
Figura 1. automatizado de detección de C. inclusiones trachomatis. células (A) GFP-HeLa fueron infectadas con (B) mKate2-expresión de C. trachomatis L2 y fotografiado en vivo en 24 hpi. Un algoritmo basado en software de imagen se utilizó para identificar automáticamente las inclusiones clamidias por (C) la selección de los agujeros negros en las células GFP-HeLa, marcados en naranja. (D) Una imagen compuesta de las células infectadas de los paneles A y B también se muestra. La barra de escala = 20 micras. .jove.com / archivos / ftp_upload / 51131 / 51131fig1large.jpg "target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. La cuantificación de unidades formadoras de inclusión clamidia (IFU) en GFP-células HeLa. Células GFP-HeLa fueron infectados con C. trachomatis L2 en dos multiplicidades diferentes de la infección y fotografiado a 24 hpi. Se detectaron Inclusiones para 10 campos por infección y enumeraron usando software automatizado y se dan los resultados (n = 3). Las barras de error representan el error estándar de la media. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Figura 3. Evolución temporal de C. trachomatis serovar L2, C. trachomatis serovar D, C. muridarum, y C. pneumoniae infección en células GFP-HeLa. células GFP-HeLa fueron infectados con C. trachomatis LGV serovar L2 y fotografiado por microscopía de fluorescencia en vivo en (A) 16 hpi, (B) 24 hpi, y (C) 48 hpi. Células GFP-HeLa infectadas con C. trachomatis serotipo D fueron imágenes en (D) 16 hpi, (E) 24 hpi, y (F) 48 hpi. Células GFP-HeLa infectadas con C. muridarum fueron imágenes al (G) 16 hpi, (H) 24 hpi, y (I) 48 hpi. Células GFP-HeLa infectadas con C. pneumoniaefueron imágenes al (J) 16 hpi, (K) 24 hpi, y (L) 48 hpi. Se muestran imágenes representativas de todas las infecciones y horas. Las barras de escala = 20 micras. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4. datos cuantitativos representativos derivan de experimentos de tiempo. Inclusiones de células GFP-HeLa infectadas con (A) C. trachomatis LGV serovar L2, (B) C. trachomatis serovar D, (C) C. muridarum, y (D) C. pneumoniae fueron detectados y enumeró a los 16, 24 y 48 hpi (5 campos por intervalo de tiempo, n = 3). Características físicas de Chlaminclusiones ydial se cuantificaron para el área de la inclusión de la superficie, la inclusión perímetro de longitud, y el número de inclusiones por célula. Las barras de error representan la SEM. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Haga clic aquí para ver el vídeo. Película 1. Time lapse video de células mCherry-HeLa infectadas con GFP C. trachomatis L2, tomada a las 48 hpi. Video fue compilado a partir de una serie de imágenes con lapso de tiempo tomadas a intervalos de 5 min para 125 min. Suplentes de vídeo en bucle a través de las células mCherry-HeLa (rojo), C. trachomatis L2 (verde) y una combinación de ambos campos.
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Discussion
Aquí se describe la estrategia experimental para la generación de células huésped fluorescentes para visualización en tiempo real y análisis de inclusiones de Chlamydia. Este enfoque visualización vacuola confiere la poderosa capacidad de iluminar, rastrear y cuantitativamente medir las propiedades dinámicas de inclusiones clamidias través de las poblaciones de células o en células individuales en el tiempo. Inclusiones de Chlamydia en las células de proteínas etiquetados fluorescentes están sorprendentemente bien definidos, de tal manera que son fáciles de identificar sin la necesidad de procesamiento adicional de inmunofluorescencia. Además, este enfoque es lo suficientemente sensible para resolver firma morfológica diferencias que diferentes especies de Chlamydia y cepas poseen, tales como el número de vacuolas por curvatura celular y la inclusión. Además, nos demuestran cómo el software de imágenes se puede adaptar para identificar automáticamente las inclusiones en las buenas prácticas agrarias que expresan las células huésped. El obviation de pasos inmunofluorescencia etiquetado para illumination de inclusiones clamidias se traduce en importantes ahorros de tiempo y costes para el usuario para los ensayos de punto final, tales como la determinación de unidades formadoras de inclusión (IFU). Además, la capacidad de inclusiones de imagen en células vivas permite la misma población de células infectadas a analizar en momentos precisos durante el ciclo de desarrollo clamidial, reduciendo así el número de pocillos o placas necesarias para los estudios de curso temporal. Citosólica GFP, mCherry, etc., dió una señal brillante, estable que no sufren de photobleaching; esta característica es fundamental para largos experimentos de imagen de lapso de tiempo. Finalmente, debido a que la técnica es independiente de la expresión de genes del desarrollo Chlamydia, es igualmente eficaz en todas las etapas de la infección celular por Chlamydia.
En comparación con las estrategias existentes para intracelular etiquetado clamidia y membranas 7,8, esta técnica ofrece simplicidad y flexibilidad para una experimentalplicaciones. Células huésped infectadas con Chlamydia fluorescentes se pueden obtener imágenes de inmediato, sin necesidad de colorante de carga, etiquetado u otras manipulaciones celulares. Este enfoque se ilumina claramente y define los bordes de la inclusión mientras se mantiene el espacio luminal de la inclusión (y las bacterias) no marcado. Para el propósito de iluminar y enumerando las células infectadas por Chlamydia, la ventaja de este enfoque reside principalmente en su compatibilidad con cultivos vivos, y por lo tanto los ahorros de tiempo significativos que proporciona. Sin embargo, para el etiquetado y la derivación de los parámetros cuantitativos de la Chlamydia contiene en sí vacuola, los anticuerpos comerciales para este compartimiento no están ampliamente disponibles. En consecuencia, el enfoque de las buenas prácticas agrarias invertida sigue siendo el medio más fáciles y directos para la demarcación de la membrana de este compartimento de agentes patógenos.
Hay consideraciones clave para la aplicación de este método de imagen a un visualizat Chlamydiaflujo de trabajo de iones. Es importante que las líneas de células huésped con la expresión estable de GFP, mCherry, etc, se generan por adelantado. Aunque inclusiones clamidias se detectan fácilmente en las células huésped que son transfectadas transitoriamente con proteínas fluorescentes, las células preparadas de esta manera sufren de transfección incompleta a través de la población, así como los niveles de expresión variable. Además, la transfección añade pasos innecesarios en el procedimiento general. Otra limitación del método descrito es que las inclusiones derivadas de diferentes Chlamydia spp. puede ser notablemente diferente en su aspecto morfológico y la manera en que interactúan con la célula huésped. Este enfoque de formación de imágenes es bastante robusto para la detección y formación de imágenes que contienen inclusiones de C. trachomatis, C. muridarum o C. pneumoniae; sin embargo, para algunas especies de Chlamydia (especialmente C. psittaci y C. caviae) inclusiones son menos capaces de excluir GFP de su espacio luminal. Las inclusiones contienen C. psittaci o C. caviae son fácilmente visibles en las células GFP-HeLa, pero la intrusión de algunos GFP en estas inclusiones aumenta la tasa de error de software basado en la detección de inclusiones.
Una vez que la estrategia experimental general se ha aplicado correctamente, se crean nuevas oportunidades para el análisis cuantitativo de las inclusiones de Chlamydia en las células vivas. Demostramos cómo esta técnica permite un flujo de trabajo optimizado para la enumeración de inclusión - ya sea de manera automatizada mediante software de imágenes, o de puntuación manual. Una nueva aplicación de este enfoque es para la derivación de los datos cuantitativos significativas acerca de la inclusión, por ejemplo, el área de la inclusión, volumen y forma. Por último, este método de visualización es altamente adaptable y se puede utilizar en combinación con otros marcadores fluorescentes para revelar información adicional sobre la biología de las células huésped infectadas por Chlamydia, por ejemploGFP o mKate2-expresión de Chlamydia 6,11, actina fluorescente 12 o GFP etiquetados proteínas Inc 13.
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Disclosures
Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668 | |
| Opti-Mem | Invitrogen | 31985 | |
| Polybrene | Sigma | H9268 | |
| 0.45 µm filters | Fisher | 09-719D | |
| G418 | Invitrogen | 10131 | |
| HBSS | Invitrogen | 14025 | |
| DMEM | Invitrogen | 11995 | |
| RPMI 1640 | Invitrogen | 11875 | |
| RPMI 1640 w/o phenol red | Cellgro | 17-105-CV | |
| Penicillin G | Sigma | 13752 | |
| Cycloheximide | Sigma | C7698 | |
| Glass bottom dishes | MatTek | P35G-1.5-14-C | |
| Chamber slides, Lab-Tek II | Nunc | 154526, 154534 |
References
- Stamm, W. E. Chlamydia trachomatis infections: progress and problems. The Journal of Infectious Diseases. 179, Suppl 2. S380-S383 (1999).
- Schachter, J. Infection and disease epidemiology. Chlamydia: Intracellular Biology, Pathogenesis, and Immunity. Stephens, R. S. , ASM Press. 139-169 (1999).
- Campbell, L. A., Kuo, C. C. Chlamydia pneumoniae--an infectious risk factor for atherosclerosis. Nature Reviews Microbiology. 2 (1), 23-32 (2004).
- Darville, T., Hiltke, T. J. Pathogenesis of genital tract disease due to Chlamydia trachomatis. The Journal of Infectious Diseases. 201, Suppl 2. S114-S125 (2010).
- Hackstadt, T. Cell biology. Chlamydia: Intracellular Biology, Pathogenesis, and Immunity. Stephens, R. S. , ASM Press. 101-138 (1999).
- Wang, Y., Kahane, S., Cutcliffe, L. T., Skilton, R. J., Lambden, P. R., Clarke, I. N. Development of a transformation system for Chlamydia trachomatis: restoration of glycogen biosynthesis by acquisition of a plasmid shuttle vector). PLoS Pathogens. 7 (9), e1002258 (2011).
- Hackstadt, T., Scidmore, M. A., Rockey, D. D. Lipid metabolism in Chlamydia trachomatis-infected cells: directed trafficking of Golgi-derived sphingolipids to the chlamydial inclusion. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (11), 4877-4881 (1995).
- Boleti, H., Ojcius, D. M., Dautry-Varsat, A. Fluorescent labelling of intracellular bacteria in living host cells. Journal of Microbiological Methods. 40 (3), 265-274 (2000).
- Hybiske, K., Stephens, R. S. Mechanisms of host cell exit by the intracellular bacterium Chlamydia. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (27), 11430-11435 (2007).
- Heinzen, R. A., Hackstadt, T. The Chlamydia trachomatis parasitophorous vacuolar membrane is not passively permeable to low-molecular-weight compounds. Infection and Immunity. 65 (3), 1088-1094 (1997).
- Wickstrum, J., Sammons, L. R., Restivo, K. N., Hefty, P. S. Conditional gene expression in Chlamydia trachomatis using the tet system. PLoS One. 8 (10), 10-1371 (2013).
- Chin, E., Kirker, K., Zuck, M., James, G., Hybiske, K. Actin recruitment to the Chlamydia inclusion is spatiotemporally regulated by a mechanism that requires host and bacterial factors. PLoS One. 7 (10), e46949 (2012).
- Agaisse, H., Derré, I. A C. trachomatis cloning vector and the generation of C. trachomatis strains expressing fluorescent proteins under the control of a C. trachomatis promoter. PLoS One. 8 (2), e57090 (2013).
