Bruke Fluorescent Proteiner å visualisere og kvantifisere<em> Chlamydia</em> Vakuole Vekst Dynamics i levende celler

Summary

A live cell fluorescent protein based method for illuminating cellular vacuoles (inclusions) containing Chlamydia is described. This strategy enables rapid, automated determination of Chlamydia infectivity in samples and can be used to quantitatively investigate inclusion growth dynamics.

Abstract

The obligate intracellular bacterium Chlamydia elicits a great burden on global public health. C. trachomatis is the leading bacterial cause of sexually transmitted infection and also the primary cause of preventable blindness in the world. An essential determinant for successful infection of host cells by Chlamydia is the bacterium’s ability to manipulate host cell signaling from within a novel, vacuolar compartment called the inclusion. From within the inclusion, Chlamydia acquire nutrients required for their 2-3 day developmental growth, and they additionally secrete a panel of effector proteins onto the cytosolic face of the vacuole membrane and into the host cytosol. Gaps in our understanding of Chlamydia biology, however, present significant challenges for visualizing and analyzing this intracellular compartment. Recently, a reverse-imaging strategy for visualizing the inclusion using GFP expressing host cells was described. This approach rationally exploits the intrinsic impermeability of the inclusion membrane to large molecules such as GFP. In this work, we describe how GFP- or mCherry-expressing host cells are generated for subsequent visualization of chlamydial inclusions. Furthermore, this method is shown to effectively substitute for costly antibody-based enumeration methods, can be used in tandem with other fluorescent labels, such as GFP-expressing Chlamydia, and can be exploited to derive key quantitative data about inclusion membrane growth from a range of Chlamydia species and strains.

Introduction

Smittsomme sykdommer forårsaket av arter av den intracellulære bakterien Chlamydia lokke fram en stor byrde på global helse, inkludert seksuelt overførbare sykdommer, bekkeninfeksjon, blindhet, lungebetennelse og muligens aterosklerose ^1-4. Muligheten av Chlamydia til å samhandle med vertscellen, innenfra en vakuole (betegnet inkludering), er en kritisk determinant for deres vellykkede infeksjon av celler og verten. Inkludering er en roman patogene rommet som gjør at klamydia vekst og dynamisk endres hele 2-3 dagers utviklingssyklus av Chlamydia ^5. Den obligat intracellulære natur Chlamydia presenterer en rekke utfordringer til forskersamfunnet, særlig for direkte å studere den unike biologi av inkludering. Et stort handicap har vært manglende evne til å effektivt visualisere enten intracellulær klamydia eller deres inkludering av fluorescerende tilnærminges i levende celler. En fersk oppdagelse har endelig avslørt midler til å generere GFP uttrykke C. trachomatis ^6; imidlertid har dette funnet ennå ikke førte til spesifikk merking av inkluderingen. Noen teknikker er blitt beskrevet for merking av bakterier og inneslutninger ^7,8, men de lider av svakheter som ikke-spesifisitet, transiency og mottakelighet for fotobleking. En viktig oppdagelse av vår gruppe etablert en ny strategi for å belyse inkludering ved hjelp av GFP uttrykke vertsceller ^9. Denne strategien rasjonelt utnytter den iboende ugjennomtrengelighet av inkludering membranen til molekyler som er større enn 520 Da ^10. Når cellene er konstruert for å stabilt uttrykke en bestemt cytosolisk fluorescerende protein (f.eks GFP eller mCherry), Chlamydia slutninger er synlig med bemerkelsesverdig klarhet ved deres fullstendig utelukkelse av fluorescens. Denne omvendte bildebehandling strategi muliggjør umiddelbar visualisering av inneslutninger for all Chlamydia arter og det kan lett tilpasses for de fleste vertsceller av interesse. Som en demonstrasjon av sin nytteverdi, ble denne metoden tidligere brukt til å avdekke og definere de cellulære exit trasé for Chlamydia spp ^9.

Her har vi videre vise hvordan denne fremgangsmåten utføres, og kan utnyttes til å utlede sentrale kvantitative data om inkludering vekst dynamikk. Videre kan det effektivt å erstatte kostbare antistoffbaserte oppregning metoder og kan brukes i tandem med andre fluorescerende markører, slik som mKate2-uttrykkende Chlamydia ^11. Denne kraftige kombinasjonen av verktøy muliggjør utforskning av de fysiske egenskapene til chlamydial inkludering membran inne levende vertsceller.

Protocol

1. generasjon av Fluorescent vertscellelinjer Dag 1. Plate 293T celler (eller andre retrovirale emballasje linje) på seks-brønns plater på 2 x 10 6 celler / brønn, for å være ~ 75% konfluent neste dag. Dersom det er ønskelig, for å plate duplikate brønner for hver retrovirus anvendes. Dag 2. Sug celler og tilsett 2 ml frisk vekst medium (DMEM + 10% FBS + 2 mM L-glutamin). Transfektere celler med 5-8 mikrogram hver av retrovirusvektoren (som inneholder GFP) og pakking vektor (…

Representative Results

Pattedyrceller uttrykker cytosolic fluorescerende proteiner (f.eks GFP) kan være konstruert for å muliggjøre belysning av Chlamydia slutninger i levende, infiserte cellekulturer. Ved infeksjon med Chlamydia, slutninger er lett synlige som svarte flekker i vertsceller (figur 1). Klarhet i fluorescens-mangler inneslutninger kan utnyttes for automatisert identifikasjon av inneslutninger over mange felt av syn og / eller behandlinger (figur 1). Når fluorescere…

Discussion

Her beskriver vi den eksperimentelle strategi for å generere fluorescerende vertsceller for sanntids visualisering og analyse av Chlamydia slutninger. Dette vacuole visualisering tilnærming overfører den kraftige evne til å belyse, spore og kvantitativt måle de dynamiske egenskapene til klamydiaslutninger over populasjoner av celler eller i enkeltceller over tid. Chlamydia slutninger i fluoriserende protein merket celler er påfallende godt definert, slik at de lett kan identifiseres uten behov fo…

Materials

Lipofectamine 2000	Invitrogen	11668
Opti-Mem	Invitrogen	31985
Polybrene	Sigma	H9268
0.45 µm filters	Fisher	09-719D
G418	Invitrogen	10131
HBSS	Invitrogen	14025
DMEM	Invitrogen	11995
RPMI 1640	Invitrogen	11875
RPMI 1640 w/o phenol red	Cellgro	17-105-CV
Penicillin G	Sigma	13752
Cycloheximide	Sigma	C7698
Glass bottom dishes	MatTek	P35G-1.5-14-C
Chamber slides, Lab-Tek II	Nunc	154526, 154534