Introduction
세포 내 세균의 클라미디아의 종에 의해 발생하는 감염성 질환은 성병, 골반 염증성 질환, 실명, 폐렴 가능성이 동맥 경화 1-4을 포함하여 세계 보건에 큰 부담을 유도. 액포 내에서, 숙주 세포와 상호 작용하는 클라미디아의 능력 (포함 되나), 숙주 세포의 성공적인 감염 중요한 결정 요인이다. 포함은 클라미디아 성장을 가능하게하고 동적으로 클라미디아 5의 전체 2~3일 발달주기에 걸쳐 수정 된 새로운 병원성 구획입니다. chlamydiae의 의무적 세포 내 성격은 직접 포함의 독특한 생물학을 연구, 특히 연구 커뮤니티에 많은 과제를 제시한다. 주요 장애는 효율적으로 세포 내 클라미디아 또는 형광 접근하여 그들의 포함를 시각화하는 무능력하고있다살아있는 세포에서 말이지. 최근의 발견은 마지막으로 GFP C를 표현을 생성하는 방법을 공개했다 트라코마 티스 (6); 그러나,이 연구 결과는 아직 포함 특정 라벨을 주도하지 않았습니다. 일부 기술은 박테리아 나 개재물 7,8의 표시에 대해 기재되었지만, 이러한 photobleaching에 비 - 특이 조로 감수성과 같은 단점을 겪는다. 우리 그룹에 의해 중요한 발견은 숙주 세포 (9)을 표현 GFP를 사용하여 포함을 조명하기위한 새로운 전략을 수립. 이 전략은 합리적 이상 520 다 10 분자 포접 막의 극한 투과성을 이용한다. 세포가 안정적으로 특정 세포질 형광 단백질 (예를 들면, GFP 또는 mCherry)를 발현하도록 유전자 조작 된 경우, 클라미디아 흠 형광 자신의 완전한 배제로 놀라운 선명도와 함께 볼 수 있습니다. 이 역 이미징 전략은 모든 엽록소에 대한 흠 즉시 시각화 할 수 있습니다amydia 종과 용이 관심 대부분의 숙주 세포에 대해 적응 될 수있다. 그 유틸리티의 시연으로,이 방법은 클라미디아 종 9 휴대 출구 경로를 공개하고 정의하기 위해 이전에 사용되었다.
여기서, 우리는 또한이 방법을 수행하고, 개재물의 성장 역학에 관한 정량적 데이터 키를 유도하기 위하여 이용 될 수 있는지 보여준다. 또한, 비용 효율적 항체 기반 열거 방법을 대체 할 수 있으며 클라미디아 11 mKate2 발현과 같은 다른 형광 라벨과 협력하여 사용될 수있다. 공구의 이러한 강력한 결합은 살아있는 숙주 세포 내부 클라미디아 포함 막의 물성을 탐사 할 수있다.
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Protocol
형광 숙주 세포 라인의 1 세대
- / 잘 2 × 10 6 세포에서 6 웰 플레이트에 일 1. 플레이트 293T 세포 (또는 다른 레트로 바이러스 포장 라인) ~ 75 % 합류 다음날합니다. 원한다면, 각각의 레트로 바이러스에 대한 중복 웰 플레이트가 사용될 수있다.
- 주 2. 대기음 세포 및 2를 가하여 신선한 성장 배지 (DMEM + 10 % FBS + 2 mM의 L- 글루타민). 리포 펙 타민 2000 또는 유사한 시약을 사용하여 제조업체의 지침에 따라 5-8 μg의 레트로 바이러스 벡터 (GFP를 포함) 및 포장 벡터의 각 (예., pVSVg)와 세포를 형질.
- 1 ml의 성장 매체와 매체를 교체 이후 37 ° C CO 2 배양기에서 4-6 시간 동안 DNA와 세포를 품어합니다.
- 37 ° C CO 2 배양기에서 48 시간 동안 세포를 품어.
- 일 3. 플레이트 표적 세포 (예., 헬라) 105 세포의 밀도로 대략 6 웰 플레이트 상 / 웰이 될 ~ 50 % 합류다음날. 거꾸로 현미경에 GFP의 형광을 모니터링하여 293T 세포에 긍정적 인 형질을 확인합니다.
- 주 4. 수집 레트로 바이러스 함유 0.45 μm의 셀룰로오스 아세테이트 주사기 필터를 통해 뜨는을 피펫을 사용하여 필터링 293T 세포 오프 상층 액을.
- 헬라 세포에서 매체를 제거하고 16 μg의 / ㎖의 폴리 브렌를 포함하는 0.5 ml의 성장 매체를 추가합니다. 세포에 필터링 된 레트로 바이러스의 ~ 0.5 ML을 추가 현명한 드롭, 24 시간 동안 37 ° C CO 2 배양기에서 세포를 배양한다. 4 ℃에서 (잘 복제에서, 즉) 남아있는 레트로 바이러스를 저장합니다.
- 중복 우물이 순차적으로 나머지 레트로 바이러스 입자와 감염 여분의 레트로 바이러스, 단계를 반복 1.7을 생성하는 사항이있는 경우의 날 (5).
- (예를 들어, 500 μg의 / ㎖ 네오 마이신) 10cm 접시 포함 된 선택 항생제로 1 일 6 항로는 헬라 세포 1을 형질 전환.
- 선택 antibio의 존재에 다시 성장 형질 세포에 충분한 시간을 기다립니다셀 선택 항생제의 낮은 농도의 표준 기술에 의해 전달 될 수있는 후 TIC (예., 200 μg의 / ㎖ 네오 마이신).
주 : 필요한 경우 세포 클론 적 또한,이 때 이상적인 밝기 위해 선택 될 수있다.
GFP 발현 클라미디아 트라코마 티스의 2 세대
- 배 CaCl2를 버퍼 (20 mM 트리스 산도 7.4, 100 mM의 염화칼슘 2)와 4SP 버퍼 (0.4 M 자당, 16 mM의 나 2 HPO 4)를 준비합니다.
- 주 1. 해동 냉동 C. 트라코마 티스 재고 얼음에 즉시 50 μL 배 CaCl2를 버퍼에 10 μL 박테리아를 희석. 3 μg의 플라스미드 DNA를 추가 (예., PASK-GFP - mKate2-L2)를 잘 혼합하고 25 ℃에서 30 분 동안 품어.
- 이 단계 동안, 원심 분리 튜브에 맥코이 세포를 T-75 플라스크를 trypsinizing하여 숙주 세포를 준비한다. 5 분 50 XG에 세포 현탁액을 원심 분리기 및 상층 액을 버린다. Resuspen1X CaCl2를 버퍼의 적절한 체적 D 세포 펠렛을 4 × 10 7 세포 / ㎖의 최종 농도를 얻었다.
- (단계 2.2)에서 30 분간 인큐베이션 한 후, 형질 전환 혼합물을 튜브 (200 μl의 총 부피)에 맥코이 세포를 제조 100 μL를 추가하고, 25 ℃에서 추가로 20 분 동안 배양한다. 2 ml의 성장 매체와 6 자 플레이트와 오버레이에서 하나의 잘이 형질 전환 된 세포 혼합물의 100 μl를 추가합니다. 2 일간 CO 2 인큐베이터에서 37 ℃에서 배양한다.
- 일 3.를 Lyse 맥코이 세포는 C. 감염 구부러진 1,000 μL 피펫 팁으로 세포를 1 ML의 DH 2 O와 매체를 대체하고 긁어 트라코마 티스. C의 효율적인 세포 용해 및 릴리스 5 회 1 ml의 4SP 버퍼를 추가하고 ~ 27.5 G 바늘을 통해 서스펜션을 통과 트라코마 티스.
- C.를 함유하는 세포 용 해물의 전사 2 ml를 갓 도금 MCC의 합류 단층을 함유하는 T-75 플라스크에 트라코마오우 세포; (FBS)없이 8 mL의 DMEM을 추가 C. 있도록 25 ℃에서 2 시간 동안 배양 트라코마는 세포에 부착합니다.
- 기음 세포는 10 U / ml의 페니실린 G와 1 μg의 / ㎖의 사이클로 헥시 미드와 보충 신선한 성장 매체를 추가하고. 37 ° C CO 2 배양기에서 48 시간 동안 플라스크를 품어.
- 일 4. 세포가 감염되고 흠이 비정상적 클라미디아를 포함하는 광학 현미경으로 확인합니다. 2보다 큰 μm의 직경이다 흠 내 링 형상의 객체로 표준 광학 현미경에 밝은 공포, 그리고 비정상적인 클라미디아 기관 등의 흠을 확인합니다.
- 현탁액으로 세포를 2 ML의 DH 2 O와 매체를 대체하고 긁어로 날 (5)를 Lyse 문화. 2 ml의 4SP 버퍼를 추가하고 ~ 27.5 G 바늘을 통해 5 번 정지를 전달합니다.
- 6 웰 플레이트에 하나의 웰에 맥코이 세포의 신선한 단층을 감염 세포 용 해물을 2 ㎖를 사용합니다. 25 ° C, 흡인에서 2 시간 동안 해물과 세포를 품어 신선한 성장을 추가페니실린 G 및 사이클로 헥시 미드를 포함하는 매체.
- 세포의 건강에 따라 3 ~ 5 일 동안 37 ° C CO 2 배양기에서 세포를 품어.
- 반복 (비정상적인 몸의 결여) 정상 찾고 흠이 등장 할 때까지 6 웰 플레이트에 신선한 우물에 2.9-2.10 한 번 이상, 필요에 따라, 계대 배양 단계를 반복합니다. 이 때 확인하기 위해 거꾸로 형광 현미경을 사용 C. 트라코마는 mKate2 (빨간색)을 표현한다.
- T-150 플라스크에서 재배 감염 맥코이이나 헬라 세포에서 클라미디아의 형질 전환을 수확하여, 예를 들어 높은 역가 클라미디아 주식의 생성에 감염된 문화, 최대 확장 할 수 있습니다.
3. 클라미디아와 세포를 감염
- IFU 결정 및 멀티 웰 검사 예를 들어 유리 바닥 요리 또는 챔버 슬라이드 고해상도 이미징을위한, 또는 24 웰 플레이트 원하는 배양 용기에 플레이트 GFP - 헬라 세포.
- 이리저리 해동C를 포함하는 선 튜브 트라코마 티스, C. muridarum, 또는 C 예를 MOI 1 = 얼음에 폐렴 및 감염의 원하는 다양성 (MOI)에 HBSS에 희석.
- 사용되는 특정 클라미디아의 변형을 기반으로 정적 또는 원심 분리 주었 중 감염을 수행합니다.
- C.와 감염 트라코마 티스 LGV의 혈청 형 (L2) 또는 C muridarum, HBSS로 GFP - 헬라 세포를 세척하고 25 ℃에서 2 시간 동안 희석 세균 배양한다. 기음과는 HBSS로 세포를 씻어, 37 ° C CO 2 배양기에서 배양 배지에서 세포를 배양한다.
- C. trachomatis에의 혈청 형의 D 또는 C와 감염 폐렴은, HBSS로 GFP - 헬라 세포를 씻어 세포에 희석 박테리아를 추가 할 수 있습니다. 벤치 탑 원심 분리기에서 스윙 버킷 회 전자 첨부의 멀티 웰 플레이트 홀더 멀티 웰 플레이트 (멀티 웰 플레이트 뚜껑을 테이프로 고정) 유리 바닥 접시를 놓습니다.
- 1 시간 동안 25 ° C에서 900 XG에 원심 분리기 세포. 1 시간 동안 37 ° C CO 2 배양기에서 원심과 장소에서 문화 혈관을 제거합니다.
- 기음 세포는 바이오 안전성 캐비닛에, HBSS로 두 번 세포를 씻어 신선한 성장 매체를 추가합니다. 37 ° C CO 2 인큐베이터에 넣어 세포.
클라미디아 흠 4. 라이브 셀 시각화
- CO 2 배양기에서 클라미디아 감염 GFP - 헬라 세포를 제거하고 페놀 5 + 빨간색 %의 FBS없이 RPMI와 매체를 교체하십시오.
- 20 배 이상 오일 목표를 사용하여 거꾸로 형광 현미경 (니콘 이클립스 티-E 또는 이와 유사한 것)에 마운트 세포.
- 큰 블랙홀 (클라미디아 흠)를 포함하는 녹색 세포 : 이미징 소프트웨어 (Volocity 6 또는 유사)를 사용하여,에 초점을 식별 클라미디아는 GFP - 헬라 세포를 감염.
- 마크 이미지 소프트웨어를 이용하여 관심있는 클라미디아 -infected 세포를 포함하는 영역의 XYZ 위치 (용적ocity 6 또는 이와 유사한 것). 수동으로 XY 스테이지보기 모드에서 '포인트 추가'를하여이 작업을 수행합니다. 이러한 방식으로, XYZ 좌표는 각 표시된 위치에 저장됩니다.
- 취득 설치 대화 상자에서, 녹색 (GFP, 헬라 세포질)과 빨간색 (mKate2, C. trachomatis에) 채널, 채널마다 새로운 프레임마다 5 분의 속도를 얻기 위해 소프트웨어를 구성합니다.
- 프로토콜이 "캡처 / 녹음"버튼을 클릭하여 상기 입력을 이용하여 획득 된 이미지 시퀀스를 획득.
라이브 세포에 포함 성장 매개 변수 5. 정량
- 원하는 시간에 후 감염 (예., 24, 48 HPI) 클라미디아는 인큐베이터에서 GFP - 헬라 세포를 감염 제거하고 거꾸로 형광 현미경에 장착합니다. 참고 : 높은 NA와 20 배 또는 40 배 공기의 목표는 24 웰 플레이트에 가장 적합하고, 40X 오일 목적은 챔버 슬라이드를 사용하는 것이 좋습니다. 이 엉덩이에 대한 중 하나를 기판에 세포를 성장AY.
- 흠이 자신의 최대 직경에있는 세포의 미드 플레인에 초점 선명한 가장자리를 얻을 수 있습니다.
- 각 웰 (물론 당 적어도 10)에 많은 분야에 대한 이미지를 수집; 우물은 일반적으로 복제 또는 실험 변수를 나타냅니다.
- 눈으로 (개재물 GFP-HeLa 세포 검정 구획이다), 수동 개재물의 개수를 열거 나 자동으로 개재물을 식별하고 카운트하기 위해 이미지 소프트웨어 알고리즘을 사용한다.
- 형광 강도에 의해 GFP - 헬라 세포를 찾아 (명령 '개체 찾기')를 세포의 상대 강도를 기반으로 형광 임계 강도를 조절합니다.
- 그 단지보다 5 μm의 2를 유지의 크기 지침을 사용하여 필터 선택한 객체. 이는 '인구 1'이다.
- 입력으로 '인구 1'을 사용하여 명령 '개체에 구멍 채우기'를 적용합니다. 이 단계는 "인구 2 '를 생성한다.
- '페이지에서 빼기'인구 1 'opulation 2 '인구 3'는 긍정적으로 지정 클라미디아 흠을 표시 얻었다 '.
- 예를 유지하는 객체에 대해, '인구 3'( '필터 인구'명령)에 크기 필터를 적용 24 시간 이상 감염된 세포에서 흠보다 큰 25 μm의 2. 이 흠이 훨씬 작 등의 이전에 18 시간 일찍 감염 시간, 내용, 집합 크기 필터는 4 μm의 2 이상의 개체를 유지합니다. '흠'로 지정된 객체의 인구 크기 필터링 결과.
- 이미징 소프트웨어를 사용하여 정량 예컨대 이미지 데이터, 포접 번호, 개재물 크기 및 포접 둘레를 계산한다.
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Representative Results
세포질 형광 단백질 (예를 들면, GFP)를 발현하는 포유 동물 세포는 살아있는, 감염된 세포 배양에서 클라미디아 흠의 조명을 사용하도록 설계 될 수있다. 클라미디아 감염시, 포함은 숙주 세포 (그림 1)에 검은 반점으로 쉽게 볼 수 있습니다. 형광 부족 개재물의 선명도는보기 및 / 또는 치료 (그림 1)의 여러 분야에 걸쳐 개재물의 자동 식별을 위해 이용 될 수있다. 형광 숙주 세포가 생성되면, 강력한 워크 플로우 실험 샘플에서 클라미디아 감염 수준의 빠른, 정량 분석에 사용할 수 있습니다. 하나의 주요 응용 프로그램은 라이브, 감염된 세포에서 클라미디아 포함 형성 단위 (IFU) (그림 2)의 결정이다. 이 실험 전략은 일상적 분야에서 사용되는 면역 절차에 대한 필요성을 제거 모두 시간과비용이 많이 드는.
기재된 촬상 방법의 또 다른 주요 특징은 또한 클라미디아 개재물의 중요한 생물학적 특성의 도출을 위해 이용 될 수 있고,이를 용이하게 임의의 클라미디아 종 또는 균주에 적용 할 수 있는지, 그리고. 예를 들어, GFP-HeLa 세포의 시간 경과 분석 C. 감염된 트라코마 티스 LGV의 혈청 형 (L2), C. 트라코마 티스의 혈청 형의 D, C. muridarum 및 C 폐렴 구균은 16, 24, 48 HPI (도 3)에서 수행 하였다. 이 클라미디아 종과 변종의 각각에 대해, 흠 표시 및 길이 경계, 평균 면적을 계산하기 위해 분석 및 시간에 셀 당 수는 (그림 4) 표시했다. 이러한 특성은 클라미디아 개재물의 생물학에 대한 중요한 정보를 제공하고 그들이 숙주 세포와 상호 작용하는 방법을 알려줍니다. 상술 한 방법은 SU하게이 정보를 액세스하기위한 용이 한 접근을 제공한다 다른 실험 기법에 의해 달성 될 수있는 rpasses. 역 라벨링 전략의 최종 유틸리티는 살아있는 세포에서 클라미디아 흠의 실시간 영상입니다. 이것의 예는 영화 1에 나타낸다.
C의 그림 1. 자동 감지 트라코마 흠이. (A) GFP-HeLa 세포가 (B)를 C. mKate2가 발현으로 감염시켰다 트라코마 티스 (L2)과 24 HPI에서 라이브 군데. 이미징 소프트웨어 기반 알고리즘이 자동으로 표시 오렌지 GFP-HeLa 세포에서 블랙홀, 선택 (C)에서 클라미디아 개재물을 식별하는 데 사용 하였다. (D)와 패널 B에서 감염된 세포의 합성 화상도 표시된다. 스케일 바는 20 μm의 =. .jove.com / 파일 / ftp_upload / 51131 / 51131fig1large.jpg "대상 ="_ 빈 ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2. 클라미디아 포함 형성 단위의 정량 (IFU) 세포 GFP - 헬라에서. GFP - 헬라 세포는 C.에 감염되었다 두 개의 서로 다른 감염 다중도 24 HPI에서 몇 군데에서 트라코마 티스 (L2). 당 감염 10 필드 개재물 검출 소프트웨어를 사용하여 자동화 된 열거 및 결과 부여 하였다 (N = 3). 오차 막대는 평균의 표준 오차를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
OAD / 51131 / 51131fig3.jpg "/>
C의 그림 3 시간 코스 트라코마 티스의 혈청 형 (L2), C. 트라코마 티스의 혈청 형의 D, C. muridarum 및 C 폐렴 GFP-HeLa 세포에 감염. GFP-HeLa 세포가 감염되었다 C. LGV 트라코마 티스 혈청 형의 L2 및 (A) 16 HPI, (B) 24 HPI, 및 (C)의 48 HPI 라이브 형광 현미경에 의해 촬영. GFP-HeLa 세포가 감염 C. 트라코마 티스의 혈청 형 D를 (D) 16 HPI, (E) 24 HPI, 및 (F) 48 HPI에서 몇 군데 있었다. GFP-HeLa 세포가 감염 C. muridarum은 (G) 16 HPI (H) 24 HPI, 및 (I) 48 HPI에서 몇 군데 있었다. GFP-HeLa 세포가 감염 C. 폐렴(J) (16) HPI (K) 24 HPI, 및 (L) 48 HPI에서 몇 군데 있었다. 대표 이미지는 모든 감염 및 시간 표시됩니다. 스케일 바는 20 μm의 =. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 4 주제 정량적 데이터는 시간 경과 실험으로부터 산출했다. (A) (C)로 감염된 GFP-HeLa 세포에서 흠 트라코마 티스 LGV 혈청 형 (L2), (B) (C) 트라코마 티스의 혈청 형의 D, (C) (C) muridarum, 및 (D) 다 폐렴 검출 및 16, 24에 열거 한 HPI 48 (5 필드의 시간 간격마다 N = 3) 하였다. chlam의 물리적 특성ydial 개재물 포접 표면적, 둘레 길이를 포함하고, 셀당 개재물의 수를 정량 하였다. 오차 막대는 SEM을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
이 비디오를 보려면 여기를 클릭하십시오. GFP C. 감염 mCherry - 헬라 세포의 영화 1. 시간 경과 비디오 48 HPI에서 찍은 트라코마 티스 (L2). 비디오는 125 분 동안 5 분 간격으로 촬영 시간 경과 일련의 이미지에서 컴파일. mCherry-HeLa 세포에서 루프 비디오 교대 (적색), C. 트라코마 티스 (L2) (녹색)과 두 필드의 병합.
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Discussion
여기에서 우리는 실시간으로 시각화 및 클라미디아 흠의 분석을위한 형광 숙주 세포를 생성하는 실험적인 전략을 설명합니다. 이 공포의 시각화 방법은 시간이 지남에 따라 단일 세포 세포의 인구를 통해 또는에서 클라미디아 개재물의 동적 특성을 조명 추적하고 정량적으로 측정 할 수있는 강력한 능력을 부여한다. 클라미디아 흠을 형광 단백질 표지 세포에서 눈에 띄게 잘 그들이 쉽게 식별되도록, 정의 추가 면역 처리 없이도. 또한,이 방법은 세포 및 포함 곡률 당 공포의 번호와 같은 다른 클라미디아 종과 변종이 소유한다는 서명 형태 학적 차이를 해결하기에 충분히 민감하다. 또, 촬상 소프트웨어가 자동 GFP 발현 숙주 세포에서 개재물을 식별하도록 구성 될 수있는 방법을 보여준다. 김정일에 대한 면역 형광 라벨 단계의 obviation클라미디아 개재물의 lumination는 포함 형성 단위 (IFU)의 결정으로 엔드 포인트 분석에 대해 사용자가 상당한 시간과 비용 절감을 초래한다. 감염된 세포의 동일한 모집단함으로써 시간 과정 연구 또는 필요한 웰 플레이트의 수를 줄여, 클라미디아 발달주기 동안 정확한 시간에 분석 될 수 있도록 또한, 생균의 화상 개재물하는 능력은 허용한다. 세포질 GFP, mCherry 등, photobleaching에 고생하지 않는 밝고 안정된 신호를 얻을; 이 기능은 긴 시간 경과 이미징 실험을 위해 중요하다. 기술이 발달 클라미디아 유전자 발현 독립적이기 때문에 결국, 이는 클라미디아에 의한 세포의 감염의 모든 단계에서 똑같이 유효하다.
라벨 세포 내 클라미디아와 막 7, 8에 대한 기존의 전략에 비해,이 기술은 실험을 위해 단순성과 유연성을 제공pplications. 클라미디아에 감염된 숙주 세포에 형광 염료 로딩, 라벨 또는 다른 세포에 대한 조작 할 필요없이, 바로 촬상 될 수있다. 이 방법은 명확하게 조명 및 표지되지 않은 포함 (박테리아)의 내강의 공간을 유지하면서, 개재물 에지를 정의한다. 조명 및 클라미디아 감염 세포를 열거하기위한 목적으로,이 방법의 이점은 주로 따라서 살아있는 배양하고 제공 상당한 시간 절약과의 호환성에있다. 그러나, 라벨 및 클라미디아 포함하는 공포 그 자체의 정량적 매개 변수의 도출을 위해,이 구획 상용 항체는 널리 사용할 수 없습니다. 결과적으로, 반전 된 GFP 접근법은이 병원체의 구획 막을 획정위한 가장 손쉬운 수단을 직접 유지된다.
클라미디아 visualizat이 영상 법을 적용하기위한 주요 고려 사항이 있습니다이온 흐름. 그것은 등 GFP, mCherry, 안정적 식 숙주 세포주가 미리 생성하는 것이 중요하다. 클라미디아 개재물 쉽게 형광 단백질을 일시적으로 형질 감염 숙주 세포에서 검출하고 있지만, 이와 같이 제조 된 세포 집단에 걸쳐 불완전 형질뿐만 아니라 가변 발현 겪는다. 또한, 형질 전환은 전체 과정에 불필요한 단계를 추가합니다. 한 방법의 또 다른 한계는 흠이 다른 클라미디아 종에서 파생 된 것입니다. 그들의 형태 및 모양들은 숙주 세포와 상호 작용하는 방식에 막히게 상이 할 수있다. 이 영상의 접근 방식은 감지와 C를 포함하는 영상 흠을위한 매우 강력 트라코마 티스, C. muridarum 또는 C 폐렴; 그러나, 몇 클라미디아 종 (특히 C.의 psittaci와 C caviae)에 대한 흠 G를 제외 덜 할 수있다자신의 내강 공간에서 FP. C를 포함 흠 psittaci 또는 C caviae는 GFP-HeLa 세포에서 용이하게 볼 수 있지만 이들에 어떤 GFP 개재물의 침입은 개재물의 소프트웨어 기반의 검출 에러율을 증가시킨다.
전체 실험 전략이 제대로 구현되면, 새로운 기회는 살아있는 세포에서 클라미디아 흠의 정량 분석을 위해 만들어집니다. 이미징 소프트웨어를 사용하거나 수동 채점에 의해 자동화 된 방식으로 하나 - 우리는이 기술이 포함 열거에 대한 간소화 된 워크 플로우를 허용하는 방법을 보여줍니다. 이 방법의 새로운 응용 프로그램은 예를 들어, 포함 지역, 볼륨과 모양을 포함에 대한 의미있는 정량적 데이터의 유도를위한 것입니다. 마지막으로,이 방법은 시각화 적응력이며 예컨대, 클라미디아 감염 숙주 세포 생물학에 추가적인 통찰력을 나타 내기 위해 다른 형광 마커와 병용 할 수있다GFP- 또는 mKate2 발현 클라미디아 6, 11, 형광 굴지 12 GFP는 Inc의 단백질 (13) 태그.
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Disclosures
저자는 그들이 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668 | |
| Opti-Mem | Invitrogen | 31985 | |
| Polybrene | Sigma | H9268 | |
| 0.45 µm filters | Fisher | 09-719D | |
| G418 | Invitrogen | 10131 | |
| HBSS | Invitrogen | 14025 | |
| DMEM | Invitrogen | 11995 | |
| RPMI 1640 | Invitrogen | 11875 | |
| RPMI 1640 w/o phenol red | Cellgro | 17-105-CV | |
| Penicillin G | Sigma | 13752 | |
| Cycloheximide | Sigma | C7698 | |
| Glass bottom dishes | MatTek | P35G-1.5-14-C | |
| Chamber slides, Lab-Tek II | Nunc | 154526, 154534 |
References
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