Använda fluorescerande proteiner för att visualisera och kvantifiera<em> Klamydia</em> Vacuole tillväxtdynamiken i levande celler

Summary

A live cell fluorescent protein based method for illuminating cellular vacuoles (inclusions) containing Chlamydia is described. This strategy enables rapid, automated determination of Chlamydia infectivity in samples and can be used to quantitatively investigate inclusion growth dynamics.

Abstract

The obligate intracellular bacterium Chlamydia elicits a great burden on global public health. C. trachomatis is the leading bacterial cause of sexually transmitted infection and also the primary cause of preventable blindness in the world. An essential determinant for successful infection of host cells by Chlamydia is the bacterium’s ability to manipulate host cell signaling from within a novel, vacuolar compartment called the inclusion. From within the inclusion, Chlamydia acquire nutrients required for their 2-3 day developmental growth, and they additionally secrete a panel of effector proteins onto the cytosolic face of the vacuole membrane and into the host cytosol. Gaps in our understanding of Chlamydia biology, however, present significant challenges for visualizing and analyzing this intracellular compartment. Recently, a reverse-imaging strategy for visualizing the inclusion using GFP expressing host cells was described. This approach rationally exploits the intrinsic impermeability of the inclusion membrane to large molecules such as GFP. In this work, we describe how GFP- or mCherry-expressing host cells are generated for subsequent visualization of chlamydial inclusions. Furthermore, this method is shown to effectively substitute for costly antibody-based enumeration methods, can be used in tandem with other fluorescent labels, such as GFP-expressing Chlamydia, and can be exploited to derive key quantitative data about inclusion membrane growth from a range of Chlamydia species and strains.

Introduction

Infektionssjukdomar orsakade av arter av intracellulära bakterien Chlamydia framkalla en stor börda för global hälsa, inklusive sexuellt överförbara sjukdomar, inflammatoriska sjukdomar, blindhet, lunginflammation och eventuellt åderförkalkning ^1-4. Förmågan hos Chlamydia att interagera med värdcellen, inifrån en vakuol (benämnd integration), är en kritisk determinant för deras framgångsrika infektion av celler och värden. Införandet är en ny patogen fack som möjliggör klamydiatillväxt och dynamiskt modifieras under hela 2-3 dag utvecklingscykel av Chlamydia ^5. Den obligat intracellulär natur chlamydiae innebär många utmaningar för forskarvärlden, i synnerhet för direkt studera den unika biologi integration. En stor handikapp har varit oförmågan att effektivt visualisera antingen intracellulär Chlamydia eller deras integration genom fluorescerande strategies i levande celler. En nyligen upptäckt har äntligen avslöjat metoder för att generera GFP uttrycka C. trachomatis ^6; har dock detta konstaterande ännu inte lett till särskild märkning av integration. Vissa tekniker har beskrivits för märkning av bakterier och inneslutningar ^7,8, men de lider av brister såsom icke-specificitet, KORTVARIGHET och känslighet för fotoblekning. En viktig upptäckt av vår grupp etablerat en ny strategi för att belysa införande med hjälp av GFP-uttryckande värdceller ^9. Denna strategi utnyttjar rationellt inneboende ogenomtränglighet införandet membranet molekyler större än 520 Da ^10. När celler är konstruerade för att stabilt uttrycka en viss cytosoliskt fluorescerande protein (t.ex. GFP eller mCherry), Chlamydia inneslutningar är synliga med anmärkningsvärd tydlighet av deras fullständiga uteslutning av fluorescens. Denna omvända avbildningsstrategi möjliggör omedelbar visualisering av inneslutningar för alla Chlamydia arter och det kan lätt anpassas till de flesta värdceller av intresse. Som en demonstration av dess användbarhet, denna metod som tidigare använts för att avslöja och definiera de cellulära utträde för Chlamydia spp ^9.

Här visar vi vidare hur denna metod utförs och kan utnyttjas för att härleda viktiga kvantitativa data om tillväxt integration dynamik. Vidare kan det effektivt ersätta dyra antikroppsbaserade uppräknings metoder och kan användas i tandem med andra fluorescerande märkningar, såsom mKate2-uttryck Chlamydia ^11. Denna kraftfulla kombination av verktyg möjliggör utforskning av de fysikaliska egenskaperna hos den klamydia inkludering membranet inuti levande värdceller.

Protocol

1. Generering av fluorescerande värdcellinjer Dag 1. Plate 293T-celler (eller andra retroviral förpackningslinje) på 6-brunnsplattor på 2 x 10 6 celler / brunn, vara ~ 75% konfluenta nästa dag. Om så önskas, att platt duplikatbrunnar för varje retrovirus användas. Dag 2. Aspirera celler och tillsätt 2 ml färskt odlingsmedium (DMEM + 10% FBS + 2 mM L-glutamin). Transfektera celler med 5-8 | ag (pVSVg t.ex..,) Var och en av retroviral vektor (innehållande GFP) och förp…

Representative Results

Däggdjursceller uttrycker cytosoliska fluorescerande proteiner (t.ex. GFP) kan manipuleras för att möjliggöra belysning av Chlamydia införanden i levande, infekterade cellkulturer. Vid infektion med Chlamydia, inneslutningar är lätt synliga som svarta fläckar i värdcellerna (Figur 1). Tydligheten i fluorescens saknar inneslutningar kan utnyttjas för automatisk identifiering av inneslutningar över många synfält och / eller behandling (Figur 1). Nä…

Discussion

Här beskriver vi den experimentella strategin för generering av fluorescerande värdceller för realtid visualisering och analys av Chlamydia inneslutningar. Denna vacuole visualisering metod ger den kraftfulla förmåga att belysa, spåra och kvantitativt mäta de dynamiska egenskaperna hos klamydiainneslutningar mellan populationer av celler eller i enskilda celler över tiden. Chlamydia införanden i fluorescerande protein märkta celler är slående väldefinierade, så att de lätt identifieras …

Materials

Lipofectamine 2000	Invitrogen	11668
Opti-Mem	Invitrogen	31985
Polybrene	Sigma	H9268
0.45 µm filters	Fisher	09-719D
G418	Invitrogen	10131
HBSS	Invitrogen	14025
DMEM	Invitrogen	11995
RPMI 1640	Invitrogen	11875
RPMI 1640 w/o phenol red	Cellgro	17-105-CV
Penicillin G	Sigma	13752
Cycloheximide	Sigma	C7698
Glass bottom dishes	MatTek	P35G-1.5-14-C
Chamber slides, Lab-Tek II	Nunc	154526, 154534