Summary
Aqui nós descrevemos dois ensaios para medir a ativação do complemento induzida por anticorpos contra células vermelhas do sangue. A vantagem principal sobre os ensaios actuais é a sua natureza quantitativa e fácil de interpretar.
Abstract
Os anticorpos contra os glóbulos vermelhos (hemácias) pode levar a ativação do complemento, resultando em um procedimento acelerado através de receptores do complemento no fígado (hemólise extravascular) ou levando a lise intravascular de hemácias. Aloanticorpos (por exemplo, ABO) ou auto-anticorpos contra os antigénios de RBC (como visto na anemia hemolítica auto-imune, AIHA) que conduzem à activação do complemento são potencialmente prejudiciais e podem ser - especialmente quando conduzindo à lise intravascular - fatal 1. Atualmente, a ativação do complemento devido a (auto)-anticorpos em hemácias é avaliada in vitro através do teste de Coombs refletindo deposição de complemento na RBC ou por um ensaio hemolítico não quantitativa refletindo de lise dos 1-4. No entanto, para avaliar a eficácia de inibidores de complemento, é obrigatória a existência de técnicas quantitativas. Aqui nós descrevemos dois tais técnicas. Em primeiro lugar, um ensaio para detectar a deposição de C3 e C4 em células vermelhas do sangue que é induzido por anticorpos no soro de um paciente é préapresentadas. Por isso, a análise de FACS é usado com os anticorpos anti-C3 ou anti-C4 marcados com fluorescência. Em seguida, um ensaio hemolítico quantitativa é descrito. Hemólise Neste ensaio, mediada pelo complemento induzida por soro do doente é medido fazendo uso de detecção espectrofotométrica da hemoglobina libertada. Ambos os ensaios são muito reprodutíveis e quantitativa, facilitando estudos de activação de complemento induzida pela anticorpo.
Introduction
Os anticorpos contra as células vermelhas do sangue (RBC) pode ser induzida por transfusão de glóbulos vermelhos que expressam um antigénio, que não está presente em eritrócitos de destinatários. Esses anticorpos podem causar graves alo reações transfusionais hemolíticas agudas devido à ativação do complemento no seguinte transfusão 5. Na anemia hemolítica auto-imune (AHAI), os pacientes têm auto-anticorpos contra suas próprias hemácias. Isto leva a folga acelerada das células através da interacção de IgG ligada a glóbulos vermelhos com receptores Fcy em fagócitos do baço e / ou no caso de auto-anticorpos capazes de activar o complemento por meio de receptores de complemento no fígado 6,7. Ativação do complemento fulminante resultando em hemólise intravascular é raro, mas muitas vezes fatal. Acelerado, complementam destruição de hemácias mediada induzida por qualquer auto-anticorpos ou alo resulta em anemia aguda e hipóxia tecidual, portanto, potencialmente fatal. Os auto-anticorpos em AHAI são classificadas em anticorpos quentes e frios, depending na temperatura ideal para se ligar glóbulos vermelhos (37 ° C ou inferiores, respectivamente). Os anticorpos são geralmente quentes de isotipo IgG e os anticorpos frios do isotipo IgM 8,9. AHAI pode ser derivado por exemplo, de lymphoprolyferative distúrbios, doenças dos tecidos conjuntivos, os tumores sólidos, infecções ou drogas, mas em 50% dos casos é AHAI idiopática 9.
Detecção de gamaglobulina (por exemplo. IgG ou IgM) e complementar ligada a glóbulos vermelhos do doente é realizado por meio de um teste da antiglobulina semiquantitativa directa (Coombs) (DAT). No DAT GVs do paciente são incubadas com anti-IgG ou anti-C3d. Ocorrência de RBC aglutinação demonstra a presença de componentes do complemento em anexo ou ligação IgG. A detecção de anticorpos no soro do paciente-alo ou é realizada por meio do teste da antiglobulina indirecto (TAI). No IAT, hemácias de ensaio tratados com bromelaina são incubadas com o soro de um paciente, lavadas e depois incubadas com anti-human IgG. No caso de eritrócitos foram sensibilizados com anticorpos anti-eritrócitos de IgG presente no soro do paciente a aglutinação ocorrerá. Anticorpos IgM para hemácias levará diretamente para a aglutinação de hemácias na incubação de teste tratadas com bromelina com soro do paciente. RBC aglutinação no teste de Coombs direto ou no IAT é visualmente avaliadas por meio de olho em um tubo de ensaio ou por carregar a amostra em uma pequena coluna de Sephadex separa os glóbulos vermelhos aglutinados e individuais por tamanho 1.
Uma outra técnica frequentemente utilizada para medir a activação do complemento em eritrócitos é o ensaio hemolítico 1, em que a capacidade do soro de um paciente para induzir (mediada pelo complemento) hemólise de eritrócitos tratados com bromelaina 10 é avaliada. O teste é conhecido como positivo quando o sobrenadante após a centrifugação está manchado de vermelho devido à hemoglobina liberada e considerado negativo se ele permanece incolor. Tanto o teste da antiglobulina e o ensaio hemolítico são semi-quantitativo, uma vez que a maior serum diluição é denotado na qual o teste ainda é positivo.
O teste da antiglobulina e o ensaio hemolítico são ensaios robustos que são rotineiramente utilizados em diagnósticos. Dado que estes ensaios são semi-quantitativo e depende da experiência do técnico da realização do ensaio, não são apropriados para estudar as diferenças subtis da activação do complemento em eritrócitos, conforme necessário ao avaliar a eficácia de inibidores de complemento. Por isso, desenvolvemos dois ensaios quantitativos para determinar a ativação do complemento por anticorpos (auto-) de hemácias, que vamos descrever neste artigo.
Em primeiro lugar, foi desenvolvido um ensaio para medir a deposição de fragmentos de activação do complemento C3 e C4 no RBC (Figura 1A). Neste ensaio, os humanos tratados com bromelaina tipo-0 GVs são incubadas com soro inactivado por calor paciente (fonte de anticorpos anti-RBC), soro AB fresco (fonte de complemento) e anticorpo monoclonal anti-C5 (eculizumab). Durante este incubation, a deposição de C3 e C4 ocorrerá se o soro do paciente contém complemento activando anticorpos anti-RBC. A fim de evitar lise por activação do complemento a jusante, é adicionado um anticorpo monoclonal anti-C5 de bloqueio. Em seguida, a deposição de C3 e C4 no RBC é detectada por FACS utilizando anticorpos monoclonais marcados com fluorescência ou fragmentos Fab que reagem com C3 e C4, respectivamente. Gating em único hemácias é importante para garantir a confiabilidade dos resultados. As vantagens desta técnica são as de que um pequeno volume de material paciente é necessária, a activação do complemento na fase inicial da cascata é avaliada e o método é reproduzível e quantitativo. Uma vantagem adicional de olhar para ambos C3 e C4 é que pode ser feita uma distinção entre a ativação clássica e lectina caminho (ambos C3 e C4 deposição) ea ativação da via alternativa (apenas C3 deposição). A utilização de eritrócitos tratados com bromelaina, em vez de RBC não tratada aumenta a sensibilidade do quantodizer.
O segundo ensaio é baseado no ensaio hemolítico actualmente utilizado (Figura 1B). Humanos tratados com bromelina do tipo 0 hemácias são incubadas com soro inativado pelo calor do paciente (fonte de anticorpos anti-RBC) e soro AB fresca (fonte de complemento). Se o complemento é ativado por anticorpos anti-RBC paciente, dependente da dose de lise RBC irá ocorrer, levando à liberação de hemoglobina. A quantidade de hemoglobina libertada é quantificada através da medição da sua absorvância a 414 nm no sobrenadante depois de rodar para baixo as hemácias intactos e fragmentados. A absorvência está correlacionada com a quantidade de hemólise ocorreu. Em contraste com o ensaio actualmente utilizada, este protocolo permite a um objectivo, o valor quantitativo de hemólise que é muito reprodutível e não dependente da pessoa interpreta o ensaio.
Uma aplicação destes métodos tem sido descrita em 11, onde o uso potencial de C1-inibidor como inibidor do complemento na AHAI foi studied.
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Protocol
1. Preparação de tratados com bromelina Glóbulos Vermelhos
- Glóbulos vermelhos Lave 0 tipados 3x com PBS 1x (centrifugação a 664 xg por 2-5 min).
- Incubar 1 volume de concentrado de eritrócitos com dois volumes de uma solução bromelina 0,5% por 10 min a 37 ° C.
- Lavar as células 3x com PBS 1x.
- As células podem ser armazenadas como uma solução a 3% a 4 ° C em 1 x PBS durante pelo menos uma semana.
2. C3 e C4 Análise Deposição sobre GVs por FACS
- Heat-inactivar a quantidade necessária de soro de um paciente (ou outra fonte de anticorpos anti-RBC) por aquecimento da amostra durante 30 min a 56 ° C.
- Lavar as hemácias tratados com bromelaina três vezes em VBG - (mM veronal 5, NaCl 150 mM, gelatina a 0,05%, pH 7,4) e ressuspender-los em VBG + + (VBG - + 2 mM MgCl2 + 10 mM de CaCl 2) para dar um solução a 0,5%.
- Pipetar os seguintes componentes em uma placa de fundo redondo com uma pérola de vidro (fou mistura adequada): 25 ul de 0,5% hemácias, 37,5 mL de soro fresco AB (fonte de complemento) e 37,5 mL de 200 mg / ml anti-C5. Anti-C5 é caro e pode ser difícil de obter. Pode-se considerar o uso de soro C5-/C6-/C7- ou C8-deficiente em vez de soro AB e anti-C5.
- Adicionar soro por poço para uma concentração final de 0,1-33%. Corrigir as diferenças na concentração de soro por poço usando devido inactivado por calor soro AB. Adicionar VBG + + para obter um volume final de 150 ul / poço. Fechar prato com papel alumínio ELISA.
- Incubar 1,5-2 h a 37 ° C enquanto se agita.
- Lavar as hemácias três vezes com PBS + BSA a 0,5% (de centrifugação a 664 xg durante 2 minutos).
- Adicionar marcado por fluorescência anti-C3 e os anticorpos monoclonais anti-C4 ou os seus fragmentos Fab (para reduzir a aglutinação) em PBS + BSA a 0,5% para uma concentração final de 1 ug / ml. Aqui costume desenvolveram anticorpos anti-C3-Alexa Fluor 488 e 647 de anticorpos monoclonais anti-C4-Alexa Fluor são usados, a escolha dos these marcadores fluorescentes permite a detecção simultânea de C3 e C4 por FACS.
- Incubar 30-45 min à temperatura ambiente com agitação suave.
- Lavar 3x com hemácias PBS + BSA a 0,5%.
- Ressuspender hemácias 150 mL em PBS 0,5% BSA e pipeta-los em uma nova placa (para se livrar das pérolas de vidro antes da análise FACS).
- Realizar análise FACS. Células individuais separados de parelhas em uma dispersão plotagem FSC-A; definir o portão nas hemácias individuais, selecione o canal de detecção apropriado para os sinais de fluorescência (por exemplo, FITC e APC).
- Quantificar os resultados utilizando a intensidade média de fluorescência.
Nota: É possível a utilização de um controlo do isotipo (por exemplo, marcado por fluorescência anti-IL6 IgG1 de ratinho). No entanto, recomenda-se a incluir um verdadeiro controlo negativo, por exemplo, através da incubação de eritrócitos sem soro do paciente (apenas soro AB) ou sem uma fonte de complemento (inactivado por calor soro AB e soro de um paciente inactivado pelo calor), umad em seguida corar estas com o mesmo anti-C3-Alexa Fluor 488 e anti-C4-Alexa Fluor 647 anticorpos. Isso dá um controlo mais válido do que um controlo de isotipo, no caso de células de glóbulos vermelhos 12, embora estas diferentes controlos tipicamente dar o mesmo resultado, negativo.
3. Ensaio Hemolítica Quantitative
- Heat-inactivar a quantidade necessária de soro do paciente (ou outra fonte de anticorpos anti-RBC) por aquecimento da amostra de 30 min a 56 ° C.
- Lavar 3x com hemácias VBG - e uma vez com VBG + +.
- Pipetar os seguintes componentes em uma placa de fundo redondo com uma pérola de vidro (para mistura adequada): 35 mL de 3% hemácias, 25 mL fresco soro AB (fonte de complemento) e 1-50% de soro do paciente. Corrigir as diferenças na concentração de soro inactivado por calor que utilizam soro AB. Adicionar VBG + + para obter um volume final de 150 ul / poço. Fechar prato com papel alumínio ELISA.
- Incubar a 37 ° C durante 1,5-2 h, com agitação.
- Cplaca entrifuge a 664 xg por 5 min com desaceleração reduzida (por exemplo, a desaceleração ponto final em 2-3 min).
- Pipetar cuidadosamente 90 mL de sobrenadante em uma nova placa de microtitulação. É importante nesta etapa para evitar bolhas de ar e impedir a levar células intactas.
- Meça A414/690 em espectrofotômetro adequado.
- Exprime-se o lise como uma percentagem da lise de uma amostra GVs com água pura.
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Representative Results
Figura 2A mostra um gráfico representativo de dispersão para hemácias. Gating adequado para eritrócitos individuais pode ser vista em de FSC-W - FSC-A trama (P1). Normalmente, cerca de 95% dos GVs são abrangidas por esta porta P1 (células isoladas), mas quando uma elevada percentagem de soro do paciente é usado, este pode cair para 70-80%, especialmente quando o anti-RBC IgM está presente no soro do paciente.
Os resultados representativos para o efeito de AHAI soro do paciente na deposição C4 são mostrados na Figura 2B e na deposição de C3 na Figura 2C. Como pode ser visto nessas figuras, o soro mais paciente conduz a uma maior deposição de complemento, como seria de esperar. Curiosamente, a deposição de complemento ocorre em dois picos positivos distintos. Isto, provavelmente, não é causada por heterogeneidade da população de RBC, uma vez que os GVs são desenhados a partir de um único doador. Ainda estamos investigando a causa deste fenômeno. Figuras 2D e 2E demonstraçãote a reprodutibilidade do C4 (Figura 2D) e C3 (Figura 2E), ensaios de deposição. Eles também demonstram a grande variação na capacidade de deposição de complemento das diversas amostras de doentes AIHA.
Um resultado representativo do ensaio hemolítico com uma amostra de soro de um paciente AHAI contendo auto-anticorpos de glóbulos vermelhos pode ser visto na Figura 3A. Normalmente, uma titulação com amostra de soro produz uma curva reprodutível agradável. Soros de pacientes variam consideravelmente na capacidade de ativar complemento, portanto realizar uma titulação de cada soro do paciente. Amostras sem soro do paciente, geralmente, dão um fundo em torno de 10-15% devido à absorção pela amostra de soro utilizado como fonte de complemento. Portanto, devem ser tomados cuidados para utilizar uma concentração suficientemente alta de soro do doente para obter um sinal que é substancialmente superior a este fundo. Com um inibidor do complemento adequados como anti-C5, o sinal hemolítica pode ser titulada para longe tal como mostrado na Figura 3B.
Figura 1. Visão esquemática do ensaio de C3 e C4 de deposição (A) e o ensaio hemolítico quantitativo (B). Em suma, no ensaio de deposição de C3 e C4, complementar deposição induzida por soro de paciente AHAI é medido, enquanto na hemólise ensaio hemolítico induzida pelo soro do paciente AIHA é detectado. Clique aqui para ver a imagem ampliada .
Figura 2. Os resultados representativos para a deposição de C3 e C4 umssay. A) Sugestão de gating estratégia. Mostrado aqui é como selecionar apenas para as hemácias individuais (P1, vermelho). Os aglutina são mostrados em verde (P2). B) O efeito de uma titulação de AIHA soro do paciente na deposição C4. O controle de isotipo (anti-IL6 IgG1) é mostrada como cinza sólida, enquanto a amostra é mostrado em preto. Aumentando a quantidade de soro de um paciente conduz a um aumento da deposição de C4. C) similares como B), mas agora com a detecção de deposição C3. D) C4 deposição FACS resultados representado num gráfico mostrando a reprodutibilidade do ensaio e que mostra as diferenças consideráveis entre as amostras de soro de pacientes diferentes. O eixo Y representa a intensidade média da fluorescência. E) similares como D), mas agora para a deposição de C3. clique aqui paraver imagem ampliada.
Figura 3. Os resultados representativos para os ensaios hemolíticas quantitativos. A) AIHA titulação soro do paciente no ensaio hemolítico, mostrando que a lise aumenta reprodutível com a concentração sérica do paciente. Não ocorre lise com soro dador saudável (em laranja; controlo negativo) B) Um inibidor do complemento apropriado (anti-C5, neste caso) pode revogar a lise mediada pelo complemento.. Mostrado aqui é uma titulação de anti-C5, enquanto o soro do paciente AIHA foi mantido em uma concentração constante. Clique aqui para ver a imagem ampliada .
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Discussion
Os ensaios acima são reprodutíveis e robusto. Eles são fáceis de realizar e é possível realizá-las com várias amostras ao mesmo tempo (em uma placa de 96 poços). Assim, esta abordagem também seria adequado para um sistema totalmente automatizado, por exemplo, um sistema robotizado de ELISA. Em contraste com as técnicas actualmente utilizadas, estes ensaios são quantitativos e isso irá ajudar, por exemplo, no estudo do efeito de inibidores de complemento. Além disso, a interpretação é objetiva, o que é uma melhoria sobre os ensaios usados atualmente.
Ambos os ensaios tem um passo crítico. Importante na análise FACS é portão nas hemácias individuais, porque hemácias aglutinadas dará um sinal artificialmente elevados, uma vez que eles são contados como um evento. É ainda melhor para evitar a aglutinação utilizando baixas concentrações de soro de pacientes, uma vez que baixas concentrações ainda dá bons sinais. No ensaio hemolítico, é crucial para transferir cuidadosamente o sobrenadante umepois de incubação em um novo prato, uma vez que o reporte das hemácias levará a um sinal confiável (como bolhas de ar). Recomenda-se usar hemácias 0 tipados em ambos os testes para evitar confusão com AB0 incompatibilidade ativação do complemento.
Devido à sua fiabilidade e robustez, estes ensaios são adequados para estudar a eficácia de inibidores de complemento para AHAI como demonstrado na referência 11, a fim de detectar diferenças subtis na quantitativamente a activação do complemento. Devido à sua sensibilidade desses ensaios podem detectar a activação do complemento em pacientes em que a activação do complemento em RBC é fortemente sugerida, mas não detectada pelos ensaios de rotina, tais como em AHAI Coombs-negativa, embora esta afirmação ainda requer verificação. Eles também podem ser usados para determinar a capacidade de activação do complemento de alo-anticorpos (por exemplo, induzido por transfusão de sangue ou de uma mãe Rh - rolamento de uma criança Rh +), que pode ajudar o clínico preditivot o comportamento clínico de um aloanticorpo detectado.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
SZ e DW receber uma subvenção irrestrita de Viropharma.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PBS | Fresenius Kabi | ||
| BSA | Sigma | B-4287 | |
| Barbital | Fagron | 0261 | This chemical is subject to drug regulation. |
| Sodium Barbital | Fagron | 0263 | This chemical is subject to drug regulation. |
| Gelatin | Merck | 1.0470.0500 | |
| Sodium chloride | Merck | 1.06404.1000 | |
| Magnesium Chloride | Merck | 1.05833.0250 | |
| Calcium chloride | Merck | 1.0238.0500 | |
| Dylight 488 amine reactive dye | Pierce | 46402 | |
| Dylight 650 amine reactive dye | Pierce | 62265 | |
| αC5 (Eculizumab) | Alexion Pharmaceuticals | ||
| FACS (Canto) | BD | Any FACS can be used that has the appropiate lasers. | |
| Spectrophotometer (e.g. Multiskan spectrum) | Thermo Labsystems | 1500-193 | Any spectrophotometer with the right wavelength range can be used |
| BD FACSDiva software v 6.1.2 | BD | 643629 | Any compatible FACS analysis software can be used |
| Bromelain | Sanquin | K1121 |
References
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