Summary
Her beskriver vi to assays til måling af komplement aktivering induceret af antistoffer mod røde blodlegemer. Den største fordel i forhold til de aktuelle analyser er deres kvantitative og let at fortolke naturen.
Abstract
Antistoffer mod røde blodlegemer (RBC) kan føre til komplement-aktivering resulterer i en accelereret clearance via komplement-receptorer i leveren (ekstravaskulære hæmolyse) eller fører til intravaskulær lysering af RBC'er. Alloantistoffer (fx ABO) eller autoantistoffer for RBC antigener (som set i autoimmun hæmolytisk anæmi, AIHA) fører til komplement-aktivering er potentielt skadelige og kan - især når der fører til intravaskulær lysis - fatal 1. I øjeblikket supplere aktivering på grund af (auto)-antistoffer på RBC er vurderet in vitro ved hjælp af Coombs test reflekterende komplement aflejring på RBC eller af en nonquantitative hæmolytisk assay afspejler RBC 1-4. At vurdere effekten af komplement-inhibitorer, er det imidlertid obligatorisk at have kvantitative teknikker. Her beskriver vi to sådanne teknikker. Først et assay til påvisning af C3 og C4 aflejring på røde blodlegemer, der er induceret af antistoffer i patientens serum er præsenteret. Til dette er FACS-analyse anvendes med fluorescensmærkede anti-C3-eller anti-C4-antistoffer. Dernæst er en kvantitativ hæmolytisk assay beskrevet. I dette assay komplement-medieret hæmolyse induceret af patientserum måles gør brug af spektrofotometrisk detektion af frigivet hæmoglobin. Begge disse assays er meget reproducerbare og kvantitative lette undersøgelser antistof-induceret komplement-aktivering af.
Introduction
Antistoffer mod røde blodlegemer (RBC) kan induceres ved transfusion af RBC udtrykker et antigen, som ikke er til stede på modtagende RBC'er. Disse-alloantistoffer kan forårsage alvorlige akutte hæmolytiske transfusion reaktioner på grund af komplement-aktivering på den følgende transfusion 5.. I autoimmun hæmolytisk anæmi (AIHA), patienter har auto-antistoffer mod deres egne RBC. Dette fører til accelereret clearance af celler via interaktion af IgG bundet til RBC med Fcy-receptorer på fagocytter i milten og / eller i tilfælde af auto-antistoffer i stand til at aktivere komplement via komplement-receptorer i leveren 6,7. Fulminant komplementaktivering resulterer i intravaskulær hæmolyse er sjældne, men ofte fatale. Accelereret, supplerer medieret RBC ødelæggelse fremkaldt af enten allo-eller Autoantistoffer resulterer i akut blodmangel og dermed potentielt dødelig vævshypoksi. Auto-antistoffer i AIHA er klassificeret i varme og kolde antistoffer depending på den optimale temperatur de binder sig til RBC (37 ° C eller lavere, henholdsvis). De varme antistoffer er sædvanligvis IgG isotype og kolde antistoffer af IgM-isotype 8,9. AIHA kan være sekundær til f.eks lymphoprolyferative lidelser, bindevævssygdomme, solide tumorer, infektioner eller narkotika, men i 50% af tilfældene AIHA er idiopatisk 9.
Påvisning af gammaglobuliner (IgG eller IgM f.eks.) Og supplere bundet til patientens RBC'er udføres ved hjælp af en semikvantitativ direkte antiglobulintest (Coombs) test (DAT). I DAT patient RBC inkuberes med anti-IgG eller anti-C3d. Forekomst af RBC agglutination viser tilstedeværelsen af vedlagte komplement komponenter eller IgG binding. Påvisning af allo-eller autoantistoffer i patientens serum udføres ved hjælp af den indirekte antiglobulintest (IAT). I IAT er bromelain-behandlede test RBC'er inkuberet med patientens serum, vasket og derefter inkuberet med anti-hUman IgG. I tilfælde af RBC er blevet sensibiliseret med anti-RBC IgG til stede i patientens serumagglutinationsproeve vil forekomme. IgM antistoffer mod RBC direkte vil føre til agglutination ved inkubation af bromelain-behandlede test RBC med patient serum. RBC agglutination i direkte Coombs test eller i IAT visuelt bedømmes enten ved øjet i et reagensglas eller ved at indlæse prøven på en lille Sephadex søjle adskille agglutineres og enkeltværelser RBC ved størrelse 1.
Et andet ofte anvendt teknik til at måle komplementaktivering på RBC er hæmolytisk assay 1, hvor kapaciteten af patientserum til at inducere (komplement-medieret) hæmolyse af bromelain-behandlede RBC 10 vurderes. Prøven betragtes som positivt, når supernatanten efter centrifugering farves røde på grund af frigivet hæmoglobin og anses for at være negativ, hvis den forbliver farveløs. Både antiglobulintest og hæmolytisk assay er semikvantitative, idet den højeste serum fortynding betegnes, hvor testen er stadig positiv.
Antiglobulintest og hæmolytisk assay er robuste assays, der rutinemæssigt anvendes i diagnostik. Da disse analyser er semikvantitativ og afhængig af oplevelsen af den tekniker, der udfører analysen, de er ikke egnet til at studere subtile forskelle i komplement aktivering på RBC, efter behov, når at evaluere effekten af komplement-hæmmere. Derfor har vi udviklet to kvantitative analyser til at bestemme komplement-aktivering af (auto-) antistoffer til RBC, som vi vil beskrive i dette dokument.
Først udviklede vi en analyse for at måle nedfald af aktivering fragmenter af komplement C3 og C4 på RBC (figur 1A). I dette assay humane bromelain-behandlede type 0 RBC inkuberet med varmeinaktiveret patientserum (anti-RBC-antistof kilder), frisk AB-serum (komplement kilde) og anti-C5 monoklonalt antistof (Eculizumab). I løbet af denne incubation vil C3 og C4 aflejring, hvis patienten indeholder serum supplement aktiverende anti-RBC-antistoffer. For at forhindre RBC ved nedstrøms komplementaktivering tilsættes et blokerende anti-C5-monoklonalt antistof. Dernæst C3 og C4 aflejring på RBC påvises ved FACS under anvendelse af fluorescens-mærkede monoklonale antistoffer eller Fab-fragmenter, der reagerer med C3 og C4, hhv. Gating på enkelt RBC er vigtigt at sikre pålideligheden af resultaterne. Fordelene ved denne teknik omfatter, at en lille mængde af patient-materiale er påkrævet, komplementaktivering på et tidligt stadium af kaskaden vurderes og fremgangsmåden er reproducerbare og kvantitative. En yderligere fordel ved at kigge på både C3 og C4 er, at der kan skelnes mellem den klassiske og lectin pathway aktivering (både C3 og C4 deposition) og den alternative vej aktivering (kun C3 deposition). Anvendelsen af bromelain-behandlede RBC stedet for ubehandlede RBC'er øger følsomheden af det somsige.
Det andet assay er baseret på den aktuelt anvendte hæmolytisk assay (figur 1B). Humane bromelain-behandlede type 0 RBC inkuberes med varmeinaktiveret patient serum (anti-RBC antistof source) og frisk AB serum (komplement kilde). Hvis komplement aktiveres af patientens anti-RBC-antistoffer, vil dosisafhængig RBC forekomme, hvilket fører til frigivelse af hæmoglobin. Mængden af frigjort hæmoglobin kvantificeres ved at måle dets absorbans ved 414 nm i supernatanten efter centrifugering ned de intakte og fragmenterede RBC. Absorbansen korrelerer med mængden af forekom hæmolyse. I modsætning til den aktuelt anvendte assay denne protokol giver mulighed for en objektiv, kvantitativ værdi af hæmolyse, som er meget reproducerbar og ikke afhængig af den person, der fortolker analysen.
En anvendelse af disse metoder er blevet beskrevet i 11, hvor den potentielle anvendelse af C1-inhibitor som komplementinhibitor i AIHA var studied.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.. Fremstilling af Bromelain-behandlede røde blodlegemer
- Vask 0-skrives røde blodlegemer 3x med 1x PBS (centrifugering ved 664 xg i 2-5 min.)
- Inkuber 1 volumen af pakkede RBC'er med to volumener af en 0,5% bromelain opløsning i 10 minutter ved 37 ° C.
- Vask cellerne 3x med 1x PBS.
- Cellerne kan opbevares som en 3% opløsning ved 4 ° C i 1 x PBS i mindst en uge.
2. C3 og C4 Deposition analyse om RBC ved FACS
- Heat-inaktivere den nødvendige mængde af patientserum (eller andre anti-RBC-antistof kilde) ved opvarmning af prøven i 30 minutter ved 56 ° C.
- Vask bromelain-behandlede RBC tre gange i VBG - (5 mM Veronal, 150 mM NaCl, 0,05% gelatine, pH 7,4) og resuspender dem i VBG + + (VBG - + 2 mM MgCl2 + 10 mM CaCl2) for at give en 0,5% opløsning.
- Pipettere følgende komponenter i en rundbundet plade med en glasperle (feller korrekt blanding): 25 gl 0,5% RBC, 37,5 pi frisk AB serum (komplement kilde) og 37,5 gl 200 pg / ml anti-C5. Anti-C5 er dyre og kan være vanskeligt at opnå. Man kunne overveje at bruge C5-/C6-/C7- eller C8-mangelfuld serum i stedet for AB serum og anti-C5.
- Tilføj patientserum per brønd til en endelig koncentration på 0,1 til 33%. Korrekt for forskelle i serumkoncentration per brønd grund ved hjælp af varme-inaktiveret AB serum. Tilføj VBG + + for at få et endeligt volumen på 150 gl / brønd. Tæt plade med ELISA folie.
- Inkuber 1,5-2 timer ved 37 ° C under omrystning.
- Vaskes RBC tre gange med PBS + 0,5% BSA (centrifugering ved 664 x g i 2 minutter).
- Tilføj fluorescensmærket anti-C3-og anti-C4 monoklonale antistoffer eller deres Fab-fragmenter (for at reducere agglutination) i PBS + 0,5% BSA til en slutkoncentration på 1 ug / ml. Her specialudviklet anti-C3-Alexa Fluor 488 og anti-C4-Alexa Fluor 647 monoklonale antistoffer anvendes, da valget af THESe fluorescensmærker muliggør samtidig påvisning af C3 og C4 ved FACS.
- Inkuber 30-45 min ved stuetemperatur med forsigtig omrystning.
- Vask RBC 3x med PBS + 0,5% BSA.
- Resuspender RBC 150 pi i PBS +0,5% BSA og pipette dem i en ny plade (for at slippe af med glasperler før FACS-analyse).
- Udfør FACS-analyse. Separate enkeltceller fra dubletter i et scatter plotte FSC-A, sætte porten på de enkelte RBC, vælge den relevante afsløring kanal for fluorescenssignalerne (fx FITC og APC).
- Kvantificer resultater ved hjælp af median fluorescensintensitet.
Bemærk: Det er muligt at anvende en isotypekontrol (fx fluorescens-mærket anti-IL6 muse IgG1). Det anbefales dog, at medtage en sand negativ kontrol fx ved at inkubere RBC uden patientens serum (kun AB serum) eller uden et supplement kilde (varme-inaktiveret AB serum og varmeinaktiveret patient serum), end derefter pletten disse med den samme anti-C3-Alexa Fluor 488 og anti-C4-Alexa Fluor 647-antistoffer. Dette giver en mere gyldig kontrol end en isotype kontrol i tilfælde af røde blodlegemer 12, skønt disse forskellige kontroller giver typisk den samme negative resultat.
3. Kvantitative Hæmolytisk Assay
- Heat-inaktivere den nødvendige mængde af patientsera (eller andre anti-RBC-antistof kilde) ved opvarmning af prøven i 30 minutter ved 56 ° C.
- Vask RBC 3x med VBG - og en gang med VBG + +.
- Pipette følgende komponenter i en rundbundet plade med et glas perle (for korrekt blanding): 35 pi 3% RBC, 25 ul frisk AB serum (komplement kilde) og 1-50% patient serum. Korrekt for forskelle i serumkoncentration hjælp varmeinaktiveret AB serum. Tilføj VBG + + for at få et endeligt volumen på 150 ul / brønd. Tæt plade med ELISA folie.
- Der inkuberes ved 37 ° C i 1,5-2 timer med omrystning.
- Centrifuge plade ved 664 xg i 5 min med reduceret deceleration (f.eks deceleration til fuld stop i 2-3 min.)
- Pipette forsigtigt 90 pi supernatant i en ny mikrotiterplade. Det er vigtigt på dette trin for at undgå luftbobler og for at undgå at medbringe intakte celler.
- Mål A414/690 i et egnet spektrofotometer.
- Udtryk lysis som en procentdel af lysis af en prøve RBC'er med rent vand.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 2A viser en repræsentativ scatter plot for RBC. Egnet gating for enlige RBC kan ses i de FSC-W - FSC-A plot (P1). Normalt omkring 95% af de røde blodlegemer falde ind under denne P1 gate (enkelte celler), men når en høj procentdel af patientserum anvendes, kan denne falde til 70-80%, især når anti-RBC IgM er til stede i patientens serum.
Repræsentative resultater for virkningen af AIHA patientserum på C4 deposition vist i figur 2B og C3 aflejring i figur 2c. Som det kan ses i disse figurer, mere patientserum fører til mere komplement deposition, som ville forventes. Mærkeligt forekommer komplement aflejring i to forskellige positive toppe. Dette er formentlig ikke skyldes heterogenitet i RBC befolkning, da de roede blodlegemer er hentet fra en enkelt donor. Vi er stadig ved at undersøge årsagen til dette fænomen. Figur 2D og 2E demonstrationte reproducerbarheden af C4 (figur 2D) og C3 (fig. 2E) deposition assays. De viser også den store variation i komplement aflejring kapaciteten af de forskellige AIHA patientprøver.
Et repræsentativt resultat af hæmolytiske assay med en AIHA patientserum prøve indeholdende auto-antistoffer til RBC kan ses i figur 3A. Normalt en titrering med serum prøve giver en dejlig, reproducerbar kurve. Patient sera varierer betydeligt i komplement aktiverende kapacitet derfor udføre en titrering af hver patient serum. Prøver uden patient serum normalt give en baggrund omkring 10-15% på grund af absorption af serumprøven bruges som supplement kilde. Der bør derfor udvises omhu for at anvende en tilstrækkelig høj patientserum koncentration for at opnå et signal, der er væsentligt over baggrund. Med en passende komplementinhibitor som anti-C5 kan hæmolytiske signal titreres væk som vist i Figur 3B.
Figur 1. Skematisk oversigt af C3-og C4 deposition assay (A) og det kvantitative hæmolytisk assay (B). Kort sagt i C3-og C4 deposition assay supplere deposition induceret af AIHA patientserum måles, mens den hæmolytiske assay hæmolyse fremkaldt af detekteres AIHA patient serum. Klik her for at se større billede .
Figur 2. Repræsentative resultater for C3 og C4 deposition enssay. A) Foreslået gating-strategi. Vist her er, hvordan du vælger kun for de enkelte RBC (P1, rød). Agglutinaterne er vist med grønt (P2). B) Virkningen af en titrering af AIHA patient serum på C4 deposition. Den isotypekontrol (anti-IL6 mus IgG1) vises som solid grå, mens prøven er vist i sort. Forøgelse af mængden af patientserum fører til en stigning i C4 deposition. C) Tilsvarende som B), men nu med detektion C3 deposition. D) C4 deposition FACS resultater afbildet i en graf, der viser reproducerbarheden af assayet, og som viser de betydelige forskelle mellem serumprøver fra forskellige patienter. Y-aksen repræsenterer medianen fluorescens intensitet. E) Lignende som D), men nu for C3 deposition. Klik her for atse større billede.
Figur 3. Repræsentative resultater for de kvantitative hæmolytiske assays. A) AIHA patient serumtitreringsmetode i hæmolytiske assay, der viser, at lysis stiger reproducerbart med patientens serum koncentration. Ingen lysis sker med en sund donor serum (orange, negativ kontrol) B) et egnet komplementinhibitor (anti-C5 i dette tilfælde) kan ophæve komplement-medieret lysis.. Vist her er en titrering af anti-C5, mens AIHA patientserum blev holdt ved en konstant koncentration. Klik her for at se større billede .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ovenstående analyser er reproducerbare og robust. De er nemme at udføre, og det er muligt at udføre dem med mange prøver på samme tid (i en plade med 96 brønde). Derfor vil denne fremgangsmåde også være egnet til en fuldt automatiseret system, fx et ELISA robotsystem. I modsætning til de for tiden anvendte teknikker, disse assays er kvantitative og dette vil hjælpe fx i undersøgelsen af virkningen af komplement-inhibitorer. Desuden fortolkning er objektiv, hvilket er en forbedring i forhold til de aktuelt anvendte assays.
Begge assays har et afgørende skridt. Vigtigt i FACS-analyse er at gate på de enkelte RBC, fordi agglutinerede RBC vil give et unaturligt højt signal, da de tælles som ét arrangement. Det er endnu bedre at forhindre agglutinering ved anvendelse af lave patient serum, da lave koncentrationer stadig give gode signaler. I hæmolytiske assay, er det afgørende at omhyggeligt overføre supernatanten enfter inkubation i en ny plade, vil da fremførsel af RBC føre til en upålidelig signal (som det luftbobler). Det anbefales at bruge 0-indtastet RBC i begge analyser til at undgå forveksling med AB0 mismatch komplement aktivering.
På grund af deres pålidelighed og robusthed disse assays er egnede til at undersøge effekten af komplement hæmmere til AIHA som vist i henvisning 11, for at detektere kvantitativt subtile forskelle i komplement-aktivering. På grund af deres følsomhed disse assays kan detektere komplement aktivering hos patienter, hvor komplement aktivering på RBC er kraftigt antydet, men ikke registreres af de rutinemæssige analyser, såsom i Coombs-negative AIHA, selv om denne erklæring stadig kræver verifikation. De kan også anvendes til at bestemme komplement aktiverende kapacitet allo-antistoffer (induceret af fx blodtransfusion eller i et RhD - mor bærer et RhD + barn), som kan hjælpe klinikeren forudsit den kliniske opførsel af en detekteret alloantistof.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at afsløre.
Acknowledgments
SZ og DW modtage en ubegrænset tildeling af ViroPharma.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PBS | Fresenius Kabi | ||
| BSA | Sigma | B-4287 | |
| Barbital | Fagron | 0261 | This chemical is subject to drug regulation. |
| Sodium Barbital | Fagron | 0263 | This chemical is subject to drug regulation. |
| Gelatin | Merck | 1.0470.0500 | |
| Sodium chloride | Merck | 1.06404.1000 | |
| Magnesium Chloride | Merck | 1.05833.0250 | |
| Calcium chloride | Merck | 1.0238.0500 | |
| Dylight 488 amine reactive dye | Pierce | 46402 | |
| Dylight 650 amine reactive dye | Pierce | 62265 | |
| αC5 (Eculizumab) | Alexion Pharmaceuticals | ||
| FACS (Canto) | BD | Any FACS can be used that has the appropiate lasers. | |
| Spectrophotometer (e.g. Multiskan spectrum) | Thermo Labsystems | 1500-193 | Any spectrophotometer with the right wavelength range can be used |
| BD FACSDiva software v 6.1.2 | BD | 643629 | Any compatible FACS analysis software can be used |
| Bromelain | Sanquin | K1121 |
References
- Zeerleder, S. Autoimmune haemolytic anaemia - a practical guide to cope with a diagnostic and therapeutic challenge. Neth. J. Med. 69 (4), 177-184 (2011).
- Reardon, J. E., Marques, M. B. Laboratory evaluation and transfusion support of patients with autoimmune hemolytic anemia. Am. J. Clin. Pathol. 125, 71-77 (2006).
- Lai, M., Leone, G., Landolfi, R. Autoimmune hemolytic anemia with gel-based immunohematology tests. Am. J. Clin. Pathol. 139 (4), 457-463 (2013).
- Zantek, N. D., Koepsell, S. A., Tharp Jr,, R, D., Cohn, C. S. The direct antiglobulin test: A critical step in the evaluation of hemolysis. Am. J. Hematol. 87 (7), 707-709 (2012).
- Natukunda, B., Brand, A., Schonewille, H. Red blood cell alloimmunization from an African perspective. Curr. Opin. Hematol. 17 (6), 565-570 (2010).
- Packman, C. H. Hemolytic anemia due to warm autoantibodies. Blood Rev. 22 (1), 17-31 (2008).
- Berentsen, S., Tjønnfjord, G. E. Diagnosis and treatment of cold agglutinin mediated autoimmune hemolytic anemia. Blood Rev. 26 (3), 107-115 (2012).
- Petz, L. D. Cold antibody autoimmune hemolytic anemia. Blood Rev. 22 (1), 1-15 (2008).
- Barros, M. M. O., Blajchman, M. A., Bordin, J. O. Warm autoimmune hemolytic anemia: recent progress in understanding the immunobiology and the treatment. Transfus. Med. Rev. 24 (3), 195-210 (2010).
- Endoh, T., et al. Optimal prewarming conditions for Rh antibody testing. Transfusion. 46 (9), 1521-1525 (2006).
- Wouters, D., et al. C1-esterase inhibitor concentrate rescues erythrocytes from complement-mediated destruction in autoimmune hemolytic anemia. Blood. 121 (7), 1242-1244 (2013).
- Arndt, P. A., Garratty, G. A Critical Review of Published Methods for Analysis of Red Cell Antigen-Antibody Reactions by Flow Cytometry, and Approaches for Resolving Problems with Red Cell Agglutination. Transfus. Med. Rev. 24 (3), 172-194 (2010).
