JoVE Journal > Neuroscience
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Neuroscience

العزلة والكمي لالبوتولينوم السموم العصبية من مصفوفات مجمع باستخدام مصفوفة BoTest فحوصات

Published: March 03, 2014
doi:
10.3791/51170
, , ,
1BioSentinel Inc., Madison, WI

Summary

البوتولينوم عصبي BoTest ماتريكس (بونت) فحوصات الكشف تنقية بسرعة وتحديد بونت من مجموعة من المصفوفات العينة. هنا، نقدم بروتوكول للكشف والقياس الكمي للبونت من المصفوفات سواء الصلبة والسائلة وإظهار مقايسة مع البوتوكس، والطماطم، والحليب.

Abstract

مطلوب كشف دقيق وتقدير حجم عصبي البوتولينوم (بونت) في مصفوفات معقدة للأدوية، والبيئية، واختبار عينة الغذاء. مطلوب السريع بونت اختبار المواد الغذائية خلال الطب الشرعي الفاشية، تشخيص المريض، واختبار سلامة الأغذية في حين أن المطلوب دقيقة اختبار فاعلية لتصنيع المنتجات القائمة على المخدرات بونت وسلامة المرضى. الأحيائي الماوس تستخدم على نطاق واسع لاختبار بونت هي حساسة للغاية لكنه يفتقر الى الدقة والإنتاجية اللازمة لاختبار بونت السريع والروتينية. وعلاوة على ذلك، أدى استخدام الأحيائي في الحيوانات في المكالمات من قبل السلطات التنظيمية المنتج المخدرات وأنصار حقوق الحيوان في الولايات المتحدة والخارج ليحل محل الماوس الأحيائي لاختبار بونت. وقد وضعت عدة فحوصات في المختبر الغيار التي تعمل بشكل جيد مع تنقيته بونت في مخازن بسيطة، ولكن لم يظهر معظم لتكون قابلة للتطبيق لاختبار المصفوفات في معقدة للغاية. هنا، وبروتوكول للكشف عنويرد في مصفوفات معقدة بونت باستخدام مصفوفة BoTest المقايسات. يتكون الاختبار من ثلاثة أجزاء: الجزء الأول يشمل إعداد العينات للاختبار، والجزء الثاني هو خطوة مناعي استخدام الألغام المضادة للبونت المغلفة الأضداد الخرز ممغطس لتنقية بونت من المصفوفة، والجزء الثالث الكمي بروتين المعزول بونت ل النشاط باستخدام مراسل الفلورة. يتم كتابة بروتوكول للاختبار إنتاجية عالية في لوحات 96 جيدا باستخدام المصفوفات سواء السائلة والصلبة ويتطلب حوالي 2 ساعة إعداد دليل بإجمالي مرات الفحص من 4-26 ساعة اعتمادا على نوع العينة، تحميل السم، وحساسية المطلوب. يتم عرض البيانات لبونت / A الاختبار مع الفوسفات مخزنة المالحة، وهو منتج المخدرات، والثقافة طاف والحليب 2٪، والطماطم الطازجة ويتضمن مناقشة المعايير الضرورية للنجاح الفحص.

Introduction

أعصاب البوتولينوم (BoNTs) هي المواد المعروفة فتكا، بجرعات قاتلة الإنسان في الوريد تقدر ب 1-3 نانوغرام / كغ 1،2. سبعة الأنماط المصلية مماثلة هيكليا من بونت، وصفت من A إلى G، موجودة، يتألف كل منها من سلسلة مجال الثقيلة مسؤولة عن خلية ملزمة، امتصاص، وإزفاء في العصارة الخلوية وسلسلة الضوء الذي يشفر ببتيداز داخلية الزنك 3-5. سمية رائعة من بونت النتائج من، في جزء منه، دخولها ملزمة ومحددة في الخلايا العصبية الحركية عند تقاطع العصبية والعضلية 6. مرة واحدة داخل الخلايا العصبية، وعلى وجه التحديد ببتيداز داخلية سلسلة ضوء يشق واحد أو أكثر من ذوبان N-تراعي ethylmaleimide البروتين عامل مرفق مستقبلات (فخ) البروتينات اللازمة لحويصلة الانصهار، مما يعوق الافراج عن العصبي ويؤدي إلى الشلل الرخو 7-14. والمعروف باسم مرض "التسمم الغذائي"، شلل الحجاب الحاجز والعضلات الوربية التي كتبها بونت يؤدي في النهاية إلىوردت فشل الجهاز التنفسي والموت ما لم التشخيص المبكر والعلاج.

ويرتبط المنقولة بالغذاء الإنسان التسمم الغذائي الأكثر شيوعا مع بونت الأنماط المصلية A، B، E، F و(بونت / A، بونت / B، الخ) وعادة ما ينتج عن تناول الأغذية الملوثة 15،16، على الرغم من، العديد من حالات التسمم الغذائي الجرح ولم يبلغ عن وبين متعاطي المخدرات عن طريق الحقن الوريدي 17،18. في الولايات المتحدة، والتسمم الرضع الناتجة عن ابتلاع الجراثيم كلوستريديوم من قبل الأطفال الذين تقل أعمارهم عن واحد هو الشكل الأكثر شيوعا من التسمم الغذائي 19-21. ومع ذلك، تم الإبلاغ عن تفشي المنقولة بالغذاء بونت الناتجة عن غير لائق تعليب المنزل وتجهيز الأغذية في كل من الولايات المتحدة والخارج. بين 2000-2009، تم الإبلاغ عن 338 حالة على الأقل من التسمم المنقولة بالأغذية في جميع أنحاء العالم بما في ذلك ستة قتلى 22. القدرة بسرعة وحساسية للكشف عن تفشي التسمم الغذائي المنقولة عن طريق الأغذية هو مؤشر الحرجة التي يمكن أن تساعد التشخيص المبكر 23،24. وعلاوة على ذلك، فإن طرق الكشف التي تسمح فعالة من حيث التكلفة واختبار الأغذية الروتينية تؤدي إلى تحسين الأمن الغذائي.

خصوصية بونت في الخلايا العصبية وطويلة العمر النصفي البيولوجي أيضا يجعلها العلاجية القوية. في الولايات المتحدة، يتم الموافقة على المخدرات استنادا بونت من قبل إدارة الغذاء والدواء لعلاج الحالات مستحضرات التجميل والاضطرابات العصبية والعضلية ذات الصلة بما في ذلك خطوط المقطب، خلل التوتر عنق الرحم، والصداع النصفي، وفرط نشاط المثانة، والحول. يتم توثيق العديد من التطبيقات "غير الرسمي"، بما في ذلك العلاجات جرعة عالية لضعف شديد في العضلات 25-28. دقيقة السم الكمي هو أمر حاسم لالجرعات الصحيحة، كما underdosing قد يؤدي إلى العلاج غير فعال بينما الجرعة الزائدة يضع المرضى المعرضين لخطر الآثار الجانبية الضارة المحتملة. للأسف، يتم تقاسم أي بروتوكول رجولية فحص موحدة عبر الشركات المصنعة، مما أدى إلى عدم المساواة بين الم Ù حدة تعريف المخدرات استنادا بونت-سنت 29-31.

معيار اختبار لبونت هو الأحيائي الماوس التي يتم حقن عينات بونت التي تحتوي على الغشاء البريتونى في الفئران وأعداد الوفيات المسجلة خلال 1-7 أيام 16،32،33. الأحيائي الماوس حساس جدا مع حدود الكشف (اللد) من 5-10 خريج بونت / A 34، ولكن المخاوف الأخلاقية على استخدام الحيوانات، والتكلفة العالية لتدريب الموظفين والحفاظ على مرافق الحيوان، مرات الفحص طويلة، وعدم وجود أدت بروتوكولات موحدة في المكالمات لتطوير موحدة، خالية من الحيوان بونت الاختبار وطرق القياس الكمي 35-39. مؤخرا، تم تطوير عدة أساليب القياس الكمي بونت البديلة التي توفر الماوس أو شبه الماوس الأحيائي حساسية 40-49. هذه الأساليب عادة ما تستخدم مضان، مطياف الكتلة، أو أساليب المناعية وتقديم مرات الفحص أقصر بكثير من الماوس الأحيائي بدون استخدام الحيوانات. مطياف الكتلة جنبا إلى جنب مع النهج techniq المناعيةعرضت شركة نظام الطاقة الموحد لكشف وتحديد بونت الواردة في المواد الغذائية وعينات أخرى معقدة، ولكن، ومتطلبات تدريب الموظفين والحد من المعدات المتخصصة هذه المقايسات 50-55. معظم فحوصات أخرى بديلة غير قابلة للتطبيق بسهولة لاختبار عينة معقدة أو تفتقر إلى الإنتاجية المطلوبة للاختبار الروتيني بونت. طبيعة متغير بدرجة كبيرة من اللزوجة عينة الغذاء، ودرجة الحموضة ومحتوى الملح، ومكونات المصفوفة يمثل تحديا صعبا خصوصا عندما تحاول تطوير أساليب الفحص في المختبر مع حساسية لتتناسب مع قوة متطرفة من بونت. وعلاوة على ذلك، حتى الأنظمة الوقائية بسيطة وحميدة نسبيا، مثل تلك الناجمة عن إعادة تعليق من المنتجات القائمة على المخدرات بونت، تحتوي على الملح، والزلال، والسكر مثبتات (أي السواغات) التي تؤثر بشكل كبير في المختبر بونت رجولية 56. مطلوب تنقية السم لاختبار دقة النشاط من جميع ولكن أبسط من عينات 56-59.

الوقد صممت BoTest المقايسات مصفوفة لالسريع، والإنتاجية العالية، وتقدير ثابت من بونت من عينات معقدة للغاية باستخدام المعدات التي توجد عادة في مختبرات البحوث 56،60. هذه المقايسات استخدام حبات ممغطس مرتبطة تساهميا لالمصلي محددة الأجسام المضادة للبونت لربط وعزل بونت من عينة ثم قم بإزالة التدخل مركبات المصفوفة عن طريق الغسيل. بعد الغسيل، ثم يتم كميا المقيدة النشاط بروتين بونت في رد فعل العازلة الأمثل باستخدام مراسل متوافقة مع النمط المصلي بونت التي يجري اختبارها. هذه هي بروتينات صحفيين الفلورة تتكون من السماوي N-محطة البروتين الفلوري (CFP) شاردة وبروتين فلوري الصفراء المشتقة-C محطة (فينوس) شاردة ويربطها به الركيزة بونت، وبقايا SNAP25 141-206 أو بقايا synaptobrevin 33-94 تشكل BoTest A / E أو B / D / F للصحفيين / G، على التوالي 45. ويتم رصد مراسل الانقسام من قبل بونت باستخدام فورستر نقل الطاقة الرنين (الحنق). عندما رانه مراسل سليمة، إثارة CFP النتائج في الحنق الى كوكب الزهرة، التبريد والانبعاثات CFP الانبعاثات فينوس مثيرة. الانقسام لمراسل بواسطة بونت يمنع الحنق، مما يؤدي إلى زيادة في الانبعاثات CFP وانخفاض في الانبعاثات فينوس. ويمكن بعد ذلك أن يقاس النشاط بونت كميا باستخدام نسبة من انبعاثات CFP والزهرة. اللد أقل من 3 خريج ممكنة من مجموعة واسعة من الأطعمة باستخدام 96 جيدا شكل عالية الإنتاجية لوحة 56. ويمكن الحصول على زيادة الحساسية باستخدام حجم العينة أكبر منذ مقايسة يسمح تركيز السامة على سطح حبة.

تم تطوير المقايسات مصفوفة BoTest لBoNTs A، B، E، F واختبارها ومع المواد الغذائية والأدوية، والعينات البيئية 56،60. هنا، نحن تصف إجراءات لتنفيذ هذه المقايسات للكشف عن بونت في التعقيد منخفضة (مثل الأدوية، وبونت في المخزن) وعالية التعقيد (مثل المواد الغذائية والبيئية) العينات. طرق المعالجة محددةلتتم معالجتها عدة أنواع العينة في هذا البروتوكول، وأنواع العينات وليس وصفها هنا عادة ما يمكن تكييفها باستخدام مزيج من الأساليب المقدمة. وقد تم تطوير بروتوكول واختبارها مع بونت / A ولكن قابلة للتكيف مع الأنماط المصلية بونت أخرى باستخدام المقايسات الخاصة بها كما هو موضح في أماكن أخرى 56،60.

Protocol

1. إعداد الفحص الكواشف ذوبان الجليد dithiothreitol 200X (DTT)، 10X ماتريكس تجليد العازلة (10X العازلة ملزم الآخرة)، 10X تحييد العازلة (عينات غير متوازن الطعام أو درجة الحموضة فقط)، و 10x BoTest رد فعل العازلة (10X العازلة رد فعل الآخرة) في درج…

Representative Results

ويظهر رسم تخطيطي يلخص الخطوات في البروتوكول هو موضح في الشكل 2. مقايسة بين 4-26 ساعة يتطلب لاستكمال اعتمادا على نوع العينة وحساسية الفحص المطلوب، ولكن فقط ~ 2 ساعة من التدريب العملي في الوقت المحدد. يتم إجراء الفحص في لوحات 96 جيدا، واعتمادا على نوع من التجارب ال?…

Discussion

يصف هذا البروتوكول إجراءات لقياس بونت / مجمع، holotoxin، أو كلوستريديوم الثقافة طاف في مصفوفات معقدة. البروتوكول هو نفسه، ومع ذلك، عند اختبار الأنماط المصلية الأخرى بونت (بونت مثل / B، E، F و) مع المقايسات الخاصة ماتريكس منها 56،60، على الرغم من حساسية الفحص سو…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

فإن الكتاب أود أن أشكر H. اوليفاريس وD. روج لإجراء مناقشات قيمة والمشورة. وأيد هذا البحث في جزء من جائزة SBIR NSF (IIP-1127245 لBioSentinel شركة) وعقد وزارة الدفاع (W81XWH-07-2-0045 لBioSentinel شركة).

Materials

BoTest Matrix A Botulinum Neurotoxin Detection Kit BioSentinel A1015 Detection kits for BoNT/B and F are also available.
Varioskan Flash fluorescence microplate reader Thermo-Fisher Scientific 5250040 Most monochromator- or filter-based units with 434 nm excitation and 470 and 526 nm emission capability can be used.
96-well Magnetic Bead Separation Plate V&P Scientific  VP771H Other magnetic plates may be used, but the plate should be designed to separate the beads to the side of the well.
Magnetic Bead-Compatible Plate Washer BioTek  ELx405 VSRM Optional, only required for automated plate washing.  Other magnetic bead-compatible plate washers may also be used, but should be tested before use.
Microcentrifuge Various N/A Optional, only required for samples needing centrifugation.
MixMate plate mixer Eppendorf 22674200
Orbital Shaker Various N/A Used at room temperature or at 25 °C If temperature control is available
EDTA-free Protease Inhibitor Tablets Roche 4693132001 Only required for food or environmental testing.  Protease inhibitors must be EDTA-free.
BoNT/A  Metabiologics N/A Optional, only required for standardization and quantification purposes 
Black, Flat-bottomed 96-well Plates NUNC 237105 Plates should not be treated
96-well Plate Sealing Tape Thermo Scientific 15036
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Arnon, S. S., et al. Botulinum toxin as a biological weapon: medical and public health management. J. Am. Med. Assoc. 285, 1059-1070 (2001).
  2. Gill, D. M. Bacterial toxins: a table of lethal amounts. Microbiol. Rev. 46, 86-94 (1982).
  3. Montal, M. Botulinum neurotoxin: a marvel of protein design. Annu. Rev. Biochem. 79, 591-617 (2010).
  4. Lacy, D. B., Stevens, R. C. Sequence homology and structural analysis of the clostridial neurotoxins. J. Mol. Biol. 291, 1091-1104 (1999).
  5. Montecucco, C., Schiavo, G. Structure and function of tetanus and botulinum neurotoxins. Q. Rev. Biophys. 28, 423-472 (1995).
  6. Ahnert-Hilger, G., Munster-Wandowski, A., Holtje, M. Synaptic vesicle proteins: targets and routes for botulinum neurotoxins. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 364, 159-177 (2013).
  7. Yamasaki, S., et al. Cleavage of members of the synaptobrevin/VAMP family by types D and F botulinal neurotoxins and tetanus toxin. J. Biol. Chem. 269, 12764-12772 (1994).
  8. Schiavo, G., et al. Identification of the nerve terminal targets of botulinum neurotoxin serotypes A, D, and E. J. Biol. Chem. 268, 23784-23787 (1993).
  9. Schiavo, G., et al. Tetanus and botulinum-B neurotoxins block neurotransmitter release by proteolytic cleavage of synaptobrevin. Nature. 359, 832-835 (1992).
  10. Schiavo, G., et al. Botulinum G neurotoxin cleaves VAMP/synaptobrevin at a single Ala-Ala peptide bond. J. Biol. Chem. 269, 20213-20216 (1994).
  11. Rossetto, O., et al. SNARE motif and neurotoxins. Nature. 372, 415-416 (1994).
  12. Montecucco, C., Schiavo, G. Mechanism of action of tetanus and botulinum neurotoxins. Mol. Microbiol. 13, 1-8 (1994).
  13. Blasi, J., et al. Botulinum neurotoxin A selectively cleaves the synaptic protein SNAP-25. Nature. 365, 160-163 (1993).
  14. Blasi, J., et al. Botulinum neurotoxin C1 blocks neurotransmitter release by means of cleaving HPC-1/syntaxin. EMBO J. 12, 4821-4828 (1993).
  15. Cherington, M. Clinical spectrum of botulism. Muscle Nerve. 21, 701-710 (1998).
  16. Lindstrom, M., Korkeala, H. Laboratory diagnostics of botulism. Clin. Microbiol. Rev. 19, 298-314 (2006).
  17. Werner, S. B., Passaro, D., McGee, J., Schechter, R., Vugia, D. J. Wound botulism in California, 1951-1998: recent epidemic in heroin injectors. Clin. Infect. Dis. 31, 1018-1024 (2000).
  18. Passaro, D. J., Werner, S. B., McGee, J., MacKenzie, W. R., Vugia, D. J. Wound botulism associated with black tar heroin among injecting drug users. J. Am. Med. Assoc. 279, 859-863 (1998).
  19. Brook, I. Infant botulism. J. Perinatol. 27, 175-180 (2007).
  20. Arnon, S. S. Honey, infant botulism and the sudden infant death syndrome. West J. Med. 132, 58-59 (1980).
  21. Arnon, S. S. Infant botulism. Annu. Rev. Med. 31, 541-560 (1980).
  22. Peck, M. W., Stringer, S. C., Carter, A. T. Clostridium botulinum in the post-genomic era. Food Microbiol. 28, 183-191 (2011).
  23. Sharma, S. K., Whiting, R. C. Methods for detection of Clostridium botulinum toxin in foods. J. Food Prot. 68, 1256-1263 (2005).
  24. Sobel, J. Botulism. Clin. Infect. Dis. 41, 1167-1173 (2005).
  25. Chen, S. Clinical uses of botulinum neurotoxins: current indications, limitations and future developments. Toxins. 4, 913-939 (2012).
  26. Sinha, D., Karri, K., Arunkalaivanan, A. S. Applications of Botulinum toxin in urogynaecology. Eur. J. Obstet. Gynecol. Reprod. Biol. 133, 4-11 (2007).
  27. Dmochowski, R., Sand, P. K. Botulinum toxin A in the overactive bladder: current status and future directions. BJU Int. 99, 247-262 (2007).
  28. Benecke, R., Dressler, D. Botulinum toxin treatment of axial and cervical dystonia. Disabil. Rehabil. 29, 1769-1777 (2007).
  29. Hunt, T., Clarke, K. Potency evaluation of a formulated drug product containing 150-kd botulinum neurotoxin type A. Clin. Neuropharmacol. 32, 28-31 (2009).
  30. Marchetti, A., et al. Retrospective evaluation of the dose of Dysport and BOTOX in the management of cervical dystonia and blepharospasm the REAL DOSE study. Mov. Disord. 20, 937-944 (2005).
  31. Wohlfarth, K., Sycha, T., Ranoux, D., Naver, H., Caird, D. . Dose equivalence of two commercial preparations of botulinum neurotoxin type A: time for a reassessment. 25, 1573-1584 (2009).
  32. . AOAC International, Clostridium botulinum and its toxins in foods (method 977.26 section 17.7.01). , (2001).
  33. Schantz, E. J., Kautter, D. A. Microbiological methods: standardized assay for Clostridium botulinum toxins. J. AOAC. 61, 96-99 (1978).
  34. Ferreira, J. L. Comparison of amplified ELISA and mouse bioassay procedures for determination of botulinal toxins A, B, E, and F. J. AOAC. Int. 84, 85-88 (2001).
  35. . Directive 2003/15/EC of the European Parliament and of the Council. Official Journal of the European Union. , (2003).
  36. . Report on the ICCVAM-NICEATM/ECVAM Scientific Workshop on Alternative Methods to Refine, Reduce or Replace the Mouse LD50 Assay for Botulinum Toxin Testing. Report No. 08-6416, NIH. , (2008).
  37. Bitz, S. The botulinum neurotoxin LD50 test – problems and solutions. ALTEX. 27, 114-116 (2010).
  38. Balls, M. Replacing the animal testing of botulinum toxin: time to smooth out the wrinkles. Altern. Lab. Anim. 38, 1-2 (2010).
  39. Balls, M. Botulinum toxin testing in animals: the questions remain unanswered. Altern. Lab. Anim. 31, 611-615 (2003).
  40. Singh, A. K., Stanker, L. H., Sharma, S. K. Botulinum neurotoxin: where are we with detection technologies. Crit. Rev. Microbiol. 39, 43-56 (2013).
  41. Liu, Y. Y., Rigsby, P., Sesardic, D., Marks, J. D., Jones, R. G. A functional dual-coated (FDC) microtiter plate method to replace the botulinum toxin LD50 test. Anal. Biochem. 425, 28-35 (2012).
  42. Ouimet, T., Duquesnoy, S., Poras, H., Fournie-Zaluski, M. C., Roques, B. P. Comparison of Fluorigenic Peptide Substrates PL50, SNAPtide, and BoTest A/E for BoNT/A Detection and Quantification: Exosite Binding Confers High-Assay Sensitivity. J. Biomol. Screen. , (2013).
  43. Scotcher, M. C., Cheng, L. W., Stanker, L. H. Detection of botulinum neurotoxin serotype B at sub mouse LD(50) levels by a sandwich immunoassay and its application to toxin detection in milk. PLoS One. 5, (2010).
  44. Mason, J. T., Xu, L., Sheng, Z. M., O’Leary, T. J. A liposome-PCR assay for the ultrasensitive detection of biological toxins. Nat. Biotechnol. 24, 555-557 (2006).
  45. Ruge, D. R., et al. Detection of six serotypes of botulinum neurotoxin using fluorogenic reporters. Anal. Biochem. 411, 200-209 (2011).
  46. Hines, H. B., et al. Use of a recombinant fluorescent substrate with cleavage sites for all botulinum neurotoxins in high-throughput screening of natural product extracts for inhibitors of serotypes A, B, and E. Appl. Environ. Microbiol. 74, 653-659 (2008).
  47. Gilmore, M. A., et al. Depolarization after resonance energy transfer (DARET): a sensitive fluorescence-based assay for botulinum neurotoxin protease activity. Anal. Biochem. 413, 36-42 (2011).
  48. Capek, P., Dickerson, T. J. Sensing the deadliest toxin: technologies for botulinum neurotoxin detection. Toxins. 2, 24-53 (2010).
  49. Bagramyan, K., Barash, J. R., Arnon, S. S., Kalkum, M. Attomolar detection of botulinum toxin type A in complex biological matrices. PLoS One. 3, (2008).
  50. Wang, D., Baudys, J., Kalb, S. R., Barr, J. R. Improved detection of botulinum neurotoxin type A in stool by mass spectrometry. Anal. Biochem. 412, 67-73 (2011).
  51. Parks, B. A., et al. Quantification of botulinum neurotoxin serotypes A and B from serum using mass spectrometry. Anal. Chem. 83, 9047-9053 (2011).
  52. Kalb, S. R., Goodnough, M. C., Malizio, C. J., Pirkle, J. L., Barr, J. R. Detection of botulinum neurotoxin A in a spiked milk sample with subtype identification through toxin proteomics. Anal. Chem. 77, 6140-6146 (2005).
  53. Kalb, S. R., et al. The use of Endopep-MS for the detection of botulinum toxins A, B, E, and F in serum and stool samples. Anal. Biochem. 351, 84-92 (2006).
  54. Boyer, A. E., et al. From the mouse to the mass spectrometer: detection and differentiation of the endoproteinase activities of botulinum neurotoxins A-G by mass spectrometry. Anal. Chem. 77, 3916-3924 (2005).
  55. Barr, J. R., et al. Botulinum neurotoxin detection and differentiation by mass spectrometry. Emerg. Infect. Dis. 11, 1578-1583 (2005).
  56. Dunning, F. M., et al. Detection of botulinum neurotoxin serotype A, B, and F proteolytic activity in complex matrices with picomolar to femtomolar sensitivity. Appl. Environ. Microbiol. 78, 7687-7697 (2012).
  57. Jones, R. G., Ochiai, M., Liu, Y., Ekong, T., Sesardic, D. Development of improved SNAP25 endopeptidase immuno-assays for botulinum type A and E toxins. J. Immunol. Methods. 329, 92-101 (2008).
  58. Ekong, T. A., Feavers, I. M., Sesardic, D. Recombinant SNAP-25 is an effective substrate for Clostridium botulinum type A toxin endopeptidase activity in vitro. Microbiology. 143 (pt 10), 3337-3347 (1997).
  59. Shone, C. C., Roberts, A. K. Peptide substrate specificity and properties of the zinc-endopeptidase activity of botulinum type B neurotoxin. Eur. J. Biochem. 225, 263-270 (1994).
  60. Piazza, T. M., et al. In vitro detection and quantification of botulinum neurotoxin type e activity in avian blood. Appl. Environ. Microbiol. 77, 7815-7822 (2011).
  61. Mizanur, R. M., Gorbet, J., Swaminathan, S., Ahmed, S. A. Inhibition of catalytic activities of botulinum neurotoxin light chains of serotypes A, B and E by acetate, sulfate and calcium. Int. J. Biochem. Mol. Biol. 3, 313-321 (2012).
  62. Sugii, S., Sakaguchi, G. Molecular construction of Clostridium botulinum type A toxins. Infect. Immun. 12, 1262-1270 (1975).
  63. Sharma, S. K., Ramzan, M. A., Singh, B. R. Separation of the components of type A botulinum neurotoxin complex by electrophoresis. Toxicon. 41, 321-331 (2003).
  64. Bryant, A. M., Davis, J., Cai, S., Singh, B. R. Molecular composition and extinction coefficient of native botulinum neurotoxin complex produced by Clostridium botulinum hall A strain. Protein. J. 32, 106-117 (2013).
  65. Kukreja, R. V., Singh, B. R. Comparative role of neurotoxin-associated proteins in the structural stability and endopeptidase activity of botulinum neurotoxin complex types A and E. 46, 14316-14324 (2007).
  66. Eisele, K. H., Fink, K., Vey, M., Taylor, H. V. Studies on the dissociation of botulinum neurotoxin type A complexes. Toxicon. 57, 555-565 (2011).

Tags

Botulinum NeurotoxinBoNTBoTest Matrix AssaysImmunoprecipitationFluorogenic ReporterComplex MatricesPharmaceutical TestingFood SafetyRapid DetectionQuantificationMouse BioassayIn Vitro Replacement Assays

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Dunning, F. M., Piazza, T. M., Zeytin, F. N., Tucker, W. C. Isolation and Quantification of Botulinum Neurotoxin From Complex Matrices Using the BoTest Matrix Assays. J. Vis. Exp. (85), e51170, doi:10.3791/51170 (2014).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image