Isolamento e Quantificação da neurotoxina botulínica a partir de matrizes complexas usando os BoTest Matrix Ensaios

Summary

A neurotoxina botulínica BoTest Matrix (BoNT) ensaios de detecção de purificar e quantificar rapidamente BoNT a partir de uma variedade de matrizes de amostra. Aqui, apresentamos um protocolo para a detecção e quantificação de BoNT a partir de matrizes sólidos e líquidos e demonstrar o ensaio com BOTOX, tomate e leite.

Abstract

Detecção e quantificação de neurotoxina botulínica (TB) em matrizes complexas exacta é necessário para produtos farmacêuticos, ambientais e de teste da amostra de alimento. É necessário o teste rápido BoNT de alimentos durante surto forense, o diagnóstico do paciente e testes de segurança de alimentos, enquanto for necessário os testes de potência exata para fabricação de produtos à base de drogas BoNT e segurança do paciente. O bioensaio amplamente utilizado para testes de BoNT é altamente sensível, mas não tem a precisão e rendimento necessário para o teste rápido e rotineiro BoNT. Além disso, o uso do bio-ensaio de animais resultou em apelos de autoridades reguladoras de produtos de drogas e defensores dos direitos dos animais em os EUA e no exterior para substituir o bioensaio em ratos para testar BoNT. Vários ensaios in vitro de substituição têm sido desenvolvidos que funcionam bem com BoNT purificada em tampões simples, mas a maior parte não tem sido mostrado para ser aplicável a ensaios em matrizes altamente complexas. Aqui, um protocolo para a detecção deBoNT em matrizes complexas utilizando os BoTest Matrix ensaios é apresentado. O ensaio consiste em três partes: A primeira parte envolve a preparação das amostras para teste, a segunda parte é um passo de imunoprecipitação utilizando anticorpos anti-BoNT esferas paramagnéticas revestidas de anti-corpo para purificar BoNT a partir da matriz, e a terceira parte quantifica proteolítica da BoNT isolado atividade usando um repórter fluorogênico. O protocolo é escrito para o teste de alto rendimento em placas de 96 poços utilizando matrizes tanto de líquidos e sólidos e requer cerca de 2 hr da preparação manual com tempos totais de doseamento de 4-26 horas, dependendo do tipo de amostra, carga de toxinas, e sensibilidade desejada. Os dados são apresentados para BoNT / D teste com solução salina tamponada com fosfato, um medicamento, o sobrenadante de cultura, de 2% de leite, e os tomates frescos e inclui a discussão de parâmetros críticos para o sucesso do ensaio.

Introduction

Neurotoxinas botulínicas (BoNTs) são as substâncias mais letais conhecidos, com doses letais humanos intravenosos estimadas em 1-3 ng / kg ^1,2. Sete serotipos estruturalmente semelhantes de BoNT, rotulados de A a G, existem, cada um constituído por um domínio de cadeia pesada responsável pela ligação à célula, a absorção e a translocação para o citosol e uma cadeia leve que codifica uma endopeptidase de zinco ^3-5. A toxicidade requintado de BoNT resulta, em parte, a sua entrada obrigatória e específica para os neurônios motores na junção neuromuscular ^6. Uma vez dentro do neurônio, a endopeptidase cadeia leve cliva especificamente um ou mais do-N-sensível etilmaleimida receptor solúvel da proteína fator de fixação (SNARE) proteínas necessárias para a fusão das vesículas, inibindo a liberação de neurotransmissores e levando a paralisia flácida ^7-14. Vulgarmente conhecida como a doença "botulismo", paralisia do diafragma e músculos intercostais por BoNT finalmente, resulta eminsuficiência respiratória e morte, a menos que o diagnóstico precoce eo tratamento são recebidos.

Transmitidas por alimentos Humano botulismo é mais comumente associado com BoNT sorotipos A, B, E e F (BoNT / A, BoNT / B, etc) e, geralmente, resulta da ingestão de alimentos contaminados ^15,16, embora, vários casos de botulismo de feridas foram relatados entre os usuários de drogas injetáveis ^​​17,18. Nos Estados Unidos, o botulismo infantil resultante da ingestão de esporos de Clostridium por crianças com menos de um ano de idade é a forma mais comum de botulismo ^19-21. No entanto, de origem alimentar surtos BoNT resultantes de conservas casa imprópria e processamento de alimentos foram relatados, tanto nos Estados Unidos e no exterior. Entre 2000-2009, pelo menos 338 casos de botulismo alimentar foram relatados em todo o mundo, incluindo seis mortes ^22. A capacidade de detectar com rapidez e sensibilidade surtos de botulismo de origem alimentar é uma indicação importante que pode auxiliar no diagnóstico precoce ^23,24. Além disso, os métodos de detecção que permitem que o custo-benefício e análise de alimentos de rotina vai levar à melhoria da segurança alimentar.

Especificidade neuronal do BoNT e longa meia-vida biológica, também faz com que seja um agente terapêutico potente. Nos Estados Unidos, as drogas à base de BoNT são aprovados pela Food and Drug Administration para o tratamento de condições de cosméticos e perturbações relacionadas com neuromusculares incluindo linhas glabelares, distonia cervical, enxaqueca, bexiga hiperactiva, e estrabismo. Inúmeras aplicações "off-label" são documentados, incluindo tratamentos com altas doses para a disfunção muscular grave ^25-28. Accurate quantificação de toxina é fundamental para o doseamento correcto, como subdoses podem conduzir a um tratamento ineficaz, enquanto sobredosagem coloca os doentes em risco de efeitos secundários potencialmente prejudiciais. Infelizmente, nenhum protocolo de teste de potência padronizada é compartilhada entre fabricantes, resultando em desigualdades definição unidade entre produtores de drogas baseado em BoNTcts ^29-31.

O teste padrão para BoNT é o bioensaio em que BoNT contendo amostras são injetadas por via intraperitoneal em camundongos e os números de óbitos registrados mais de 1-7 dias ^16,32,33. O bioensaio é muito sensível com limites de detecção (LOD) de 5-10 pg BoNT / A ^34, no entanto, as preocupações éticas sobre o uso de animais, o alto custo de treinamento de pessoal e manutenção de instalações de animais, longos tempos de ensaio, bem como a falta de protocolos padronizados resultou em chamadas para desenvolver padronizado, livre de animal testes BoNT e métodos de quantificação ^35-39. Recentemente, vários métodos alternativos de quantificação BoNT foram desenvolvidos que oferecem mouse ou quase-rato sensibilidade bioensaio ^40-49. Esses métodos geralmente usam de fluorescência, espectrometria de massa, ou métodos imunológicos e oferecer tempos de ensaio consideravelmente mais curto que o bioensaio em ratos sem uso de animais. Espectrometria de massa combinada com abordagens techniq imunológicaues foram mostrados para detectar e quantificar BoNT contida nos alimentos e outras amostras complexas, no entanto, os requisitos de formação de pessoal e equipamento especializado limite Estes ensaios ^50-55. A maioria dos outros ensaios alternativos não são facilmente aplicáveis ​​a testes de amostras complexas ou não têm o rendimento necessário para o teste BoNT rotina. A natureza altamente variável de viscosidade da amostra de alimento, pH, teor de sal, e constituintes da matriz apresenta um desafio especialmente difícil quando tentando desenvolver métodos in vitro de ensaio com sensibilidade para combinar a potência extrema de BoNT. Além disso, mesmo sistemas de tampão simples e relativamente benignas, tais como os que resultam da libertação de medicamentos à base de BoNT, conter sal, albumina, e estabilizadores de açúcar (isto é, excipientes) que ter um impacto significativo na potência in vitro de BoNT ^56. Purificação Toxina é necessário para testes atividade precisa de todos, mas a mais simples das amostras ^56-59.

OBoTest ensaios Matrix foram projetados para rápida, de alta taxa de transferência, e quantificação consistente de BoNT a partir de amostras de alta complexidade, utilizando equipamentos comumente encontrados em laboratórios de pesquisa ^56,60. Estes ensaios use esferas paramagnéticas covalentemente ligadas a anticorpos anti-BoNT sorotipo-específicos para ligar e seqüestrar BoNT de uma amostra e, em seguida, remover a interferir compostos de matriz por lavagem. Após a lavagem, a atividade proteolítica limite BoNT é então quantificada em um tampão de reação otimizada usando um repórter compatível com o sorotipo BoNT sendo testado. Estes repórteres são proteínas f luorogénicos que consistem de uma proteína fluorescente ciano N-terminal (PCP) e uma porção proteína fluorescente amarela derivado do C-terminal (Vénus) radical ligado por um substrato de BoNT, os resíduos 141-206 ou os resíduos de SNAP25 sinaptobrevina 33-94 constituindo o BoTest A / E ou B / D / F repórteres / g, respectivamente ^45. Repórter clivagem por BoNT é monitorado usando Förster transferência de energia por ressonância (FRET). Quando tO repórter está intacta, excitação do PCP resulta em FRET a Vênus, extinguindo PCP emissão e emissão Vênus emocionante. A clivagem do repórter por BoNT impede FRET, levando a um aumento na emissão de PCP e diminuição da emissão de Vénus. Actividade de BoNT pode então ser medida quantitativamente usando a razão das emissões PCP e Vénus. LOD inferior a 3 pg são possíveis a partir de uma vasta gama de alimentos, utilizando um formato de placa de 96 poços de alto rendimento ^56. O aumento de sensibilidade pode ser obtido usando os volumes de amostra maiores uma vez que o ensaio permite a concentração de toxina na superfície do grânulo.

Os ensaios Matrix BoTest para BoNTs A, B, E, e F foram desenvolvidos e testados com alimentos, produtos farmacêuticos e amostras ambientais ^56,60. Aqui, nós descrevemos processos para a execução destes ensaios para a detecção de BoNT em baixa complexidade (por exemplo, produtos farmacêuticos, BoNT em tampão) e alta complexidade (por exemplo, alimentos, ambiental) amostras. Métodos de processamento específicospara vários tipos de amostras são abordadas neste protocolo e tipos de amostras não descritos aqui geralmente pode ser adaptado usando uma combinação dos métodos apresentados. O protocolo foi desenvolvido e testado com BoNT / A, mas pode ser adaptado para outros serótipos de BoNT utilizando os seus respectivos ensaios, como demonstrado em outros lugares ^56,60.

Protocol

1. Preparação de ensaio Reagentes Thaw ditiotreitol 200x (DTT), 10x Matrix Binding Buffer (10x Binding seguir buffer), 10x tampão de neutralização (apenas alimentos ou de pH amostras desequilibradas) e 10x tampão de reação BoTest (doravante 10x Reaction buffer) à temperatura ambiente (RT) por 15 min ou até que esteja completamente descongelado. Ver Tabela 1 para uma lista de buffers e dos reagentes utilizados neste protocolo. Ver Tabela 2 para uma lista de materiais…

Representative Results

Um diagrama que resume as etapas do protocolo descrito é mostrado na Figura 2. O ensaio requer entre 4-26 horas para ser concluído, dependendo do tipo de amostra e sensibilidade do ensaio desejado, mas apenas ~ 2 horas de hands-on do tempo. O ensaio é realizado em placas de 96 poços e, dependendo do tipo de teste a ser realizado, permite o teste em triplicado de uma amostra de 20, incluindo as normas por placa. A Figura 3 mostra os resultados do ensaio u…

Discussion

Este protocolo descreve procedimentos para a quantificação de BoNT / A complexa, holotoxina, Clostridium ou de sobrenadante de cultura em matrizes complexas. O protocolo é o mesmo, no entanto, ao testar outros serotipos BoNT (por exemplo, de BoNT / B, E e F), com os seus respectivos ensaios de matriz ^56,60, embora a sensibilidade do ensaio irá variar entre os serotipos e ensaios. Este protocolo não conta para cada tipo de amostra possível e algumas modificações que podem ser necessá…

Materials

BoTest Matrix A Botulinum Neurotoxin Detection Kit	BioSentinel	A1015	Detection kits for BoNT/B and F are also available.
Varioskan Flash fluorescence microplate reader	Thermo-Fisher Scientific	5250040	Most monochromator- or filter-based units with 434 nm excitation and 470 and 526 nm emission capability can be used.
96-well Magnetic Bead Separation Plate	V&P Scientific	VP771H	Other magnetic plates may be used, but the plate should be designed to separate the beads to the side of the well.
Magnetic Bead-Compatible Plate Washer	BioTek	ELx405 VSRM	Optional, only required for automated plate washing.  Other magnetic bead-compatible plate washers may also be used, but should be tested before use.
Microcentrifuge	Various	N/A	Optional, only required for samples needing centrifugation.
MixMate plate mixer	Eppendorf	22674200
Orbital Shaker	Various	N/A	Used at room temperature or at 25 °C If temperature control is available
EDTA-free Protease Inhibitor Tablets	Roche	4693132001	Only required for food or environmental testing.  Protease inhibitors must be EDTA-free.
BoNT/A	Metabiologics	N/A	Optional, only required for standardization and quantification purposes
Black, Flat-bottomed 96-well Plates	NUNC	237105	Plates should not be treated
96-well Plate Sealing Tape	Thermo Scientific	15036