Wir beschreiben ein Protokoll der Echtzeit-PCR, um microRNAs in der Gehirn-Rückenmarksflüssigkeit (CSF) zu profilieren. Mit Ausnahme von RNA-Extraktionsprotokollen kann der Vorgang um RNA aus anderen Körperflüssigkeiten, Zellkulturen oder Gewebeproben extrahiert verlängert werden.
MicroRNAs (miRNAs) sind eine starke Schicht der Genregulation Führungs RISC zu Seiten mRNAs Ziel befindet und somit durch Modulation ihrer translationale Repression. Änderungen in der miRNA-Expression wurde gezeigt, dass bei der Entwicklung von allen großen komplexen Erkrankungen beteiligt sein. Darüber hinaus zeigten neuere Erkenntnisse, dass miRNAs an die extrazelluläre Umgebung sezerniert werden und in die Blutbahn und anderen Körperflüssigkeiten, wo sie mit hoher Stabilität zirkulieren kann. Die Funktion eines solchen zirkulierenden miRNAs bleibt weitgehend ungeklärt, aber systematische Hochdurchsatz-Methoden, wie z. B. miRNA-Profiling Arrays haben zur Identifizierung von miRNA-Signaturen in verschiedenen pathologischen Bedingungen, einschließlich der neurodegenerativen Erkrankungen und einige Krebsarten führen. In diesem Zusammenhang ist die Identifizierung von miRNA-Expressionsprofils in der Cerebrospinalflüssigkeit, wie in unserer jüngsten Studie berichtet, macht miRNAs attraktive Kandidaten für Biomarker-Analyse.
_content "> Es gibt verschiedene Tools für die Profilierung von microRNAs, wie Microarrays zur Verfügung, quantitative Echtzeit-PCR (qPCR) und deep sequencing. Hier beschreiben wir eine empfindliche Methode, um microRNAs in Liquor durch quantitative Echtzeit-PCR-Profil. Wir verwendet die Exiqon microRNA ready-to-use PCR menschlichen Platten I und II V2.R, die ermöglicht den Nachweis von 742 einzigartige menschliche microRNAs. Wir führten die Arrays in dreifacher Ausfertigung läuft und wir verarbeitet und analysiert Daten mit der Genex Professional 5 Software.Über dieses Protokoll, haben wir erfolgreich in verschiedenen Arten von Zelllinien und Primärzellen, Liquor, Plasma und Formalin-fixierten und in Paraffin eingebetteten Geweben Profil microRNAs.
MicroRNAs gehören zu der Familie der kleinen (21-23 nt Länge) nicht-kodierenden RNAs die Genexpression posttranskriptional regulieren. Mikro-RNAs in den extrazellulären Raum, in dem sie erscheinen, relativ stabil zu sein, sezerniert werden. Während Bestimmung von Veränderungen in der miRNA-Expression kann ein wichtiger Schritt zur Identifizierung von Biomarkern sein, die Durchführung miRNA-Profile und Handhabung einer großen Menge von Daten kann einschüchternd sein.
Hier beschreiben wir ein Protokoll von Änderungen in miRNA-Expression in der Zerebrospinalflüssigkeit von einem empfindlichen Echtzeit-PCR (für andere Körperflüssigkeiten) zu bestimmen. Wir beschreiben auch die Verwendung von Software für die Datenanalyse, einschließlich der statistischen Auswertung und grafische Darstellung der Ergebnisse. Das gesamte Verfahren ist relativ einfach und unkompliziert und in Abhängigkeit von der Anzahl der Proben, die profiliert werden und die Anzahl von Echtzeit-PCR-Maschinen verfügbar sind, auch relativ schnell. Der experimentelle Teil erfordert Genauigkeit bei der HandhabungRNA und Pipettieren in 384-Well-Platten, während der Datenanalyse Abschnitt mit Genex erfordert einige Grundkenntnisse in Informatik und Statistik.
MicroRNAs sind kleine nicht-kodierende RNAs, die die Genexpression regulieren, durch die Hemmung der Translation und / oder die Förderung der mRNA-Abbau 2. Aufgrund ihrer hohen Stabilität in zellfreien Bedingungen haben microRNAs in vielen Körperflüssigkeiten nachgewiesen worden. Außerdem hat deutliche Expressionsprofil miRNAs mit Stufe und / oder Progression bei einer Vielzahl von menschlichen Krebsarten 3-9 korreliert.
Es gibt verschiedene Tools zur Verfügung, u…
The authors have nothing to disclose.
Aus dem National Institute of Mental Health: Das beschriebene Projekt wurde von Preis Anzahl R01MH079751 (F. Peruzzi PI) unterstützt. Der Inhalt ist ausschließlich der Verantwortung der Autoren und nicht notwendigerweise die offizielle Meinung des National Institute of Mental Health oder des National Institute of Health.
Table III. List of equipment
Equipment |
Company |
Catalog Number |
Finnpipette Novus Multichannel Pipetter |
Thermo Scientific |
HH05279 |
Finntip Pipette Tips |
Thermo Scientific |
9400613 |
Thermal Cycler C1000 |
Biorad |
|
0.2 ml Low Profile, Clear PCR tubes |
Biorad |
TLS0801 |
Flat Cap Strips |
Biorad |
TLS0803 |
LightCycler® 480 Real-Time PCR System |
Roche |
|
LightCycler® 480 Sealing Foil |
Roche |
04 729 757 001 |
Refrigerated Centrifuge 5804R |
Eppendorf |
|
Swing-bucket Rotor, 4-place |
Eppendorf |
A-4-44 |
Bench-Top Mini Centrifuge |
Fisher |
05-090-100 |
Bench-Top Vortex |
Fisher |
|
1.5 ml Microcentrifuge Tubes, Sterilized |
Fisher |
02-681-5 |
Matrix Reagent Reservoir, 25 ml |
Thermo Scientific |
8093 |
Thermomixer Confort |
Eppendorf |
|
Bench-To Mini Centrifuge Sigma 1-15 |
Sigma |
|
Bench-Top Vortex |
Velp Scientifica |
F202A0173 |
Table IV. List of reagents
Reagents |
Company |
Catalog Number |
Universal c-DNA synthesis kit, 16-32 rxns |
Exiqon |
203300 |
SYBR Green master mix, Universal RT, 25 ml |
Exiqon |
203400 |
Ultrapure Distilled Water Dnase, Rnase free |
Invitrogen |
10977-015 |
MicroRNA Ready to use PCR Human Panels (I+II) V2.R |
Exiqon |
203608 |
mirVana™ miRNA isolation Kit, 40 isolations |
Ambion |
AM1556 |
MS2 RNA carrier |
Roche Applied Science |
10165948001 |
2Betamercaptoethanol 98% |
Sigma Aldrich |
M3148-25ml |
Ethanol 100% |
Carlo Erba |
64-17-5 |
Nuclease free water |
Qiagen |
1039480 |
RNAse Zap® |
Ambion |
AM9780 |