정량 실시간 PCR을 사용하여 뇌척수액의 마이크로 RNA 프로파일

Summary

우리는 뇌척수액 (CSF)에서 마이크로 RNA 프로필 실시간 PCR의 프로토콜을 설명합니다. RNA 추출 프로토콜을 제외하고, 절차는 다른 체액, 배양 된 세포 또는 조직 표본에서 추출한 RNA로 확장 될 수있다.

Abstract

마이크로 RNA (의 miRNA)는 자신의 번역 억압을 조절함으로써, 결과적으로의 mRNA에있는 사이트를 대상으로하는 RISC를 안내하여 유전자 조절의 강력한 층을 구성한다. miRNA의 발현의 변화는 모든 주요 복잡한 질병의 발달에 관여하는 것으로 밝혀졌다. 또한, 최근의 연구 결과는의 miRNA가 세포 외 환경을 분비하고 높은 안정성을 순환 할 수있는 혈액 및 기타 체액을 입력 할 수 있음을 보여 주었다. 이러한 순환의 miRNA의 기능은 크게 애매 남아 있지만, 이러한 miRNA의 프로파일 배열과 같은 체계적인 높은 처리 방법은, 신경 퇴행성 질환 및 암의 여러 종류 등 여러 가지 병적 인 상태에서의 miRNA 서명의 식별로 이어질있다. 이러한 맥락에서, 뇌척수액에서의 miRNA 발현 프로파일의 식별은, 우리의 최근의 연구에보고 된, 바이오 마커 분석의 miRNAs 매력적인 후보가 있습니다.

_content ">와 같은 마이크로 어레이와 같은 마이크로 RNA를 프로파일 링 할 수있는 몇 가지 도구가 있습니다, 정량 실시간 PCR (qPCR에), 깊은 시퀀싱. 여기에서, 우리는 정량 실시간 PCR에 의해 뇌척수액의 마이크로 RNA를 프로필에 민감한 방법을 설명합니다. 우리 Exiqon 마이크로 RNA 즉시 사용 PCR 인간의 패널을 사용하는 I와 수 II V2.R, 742 독특한 인간 마이크로 RNA의 검출. 우리는 세중 실행의 배열을 수행하고 우리가 제넥스 프로 5 소프트웨어를 사용하여 데이터를 처리하고 분석했다.

이 프로토콜을 사용하여, 우리는 성공적으로 세포 선 및 일차 전지, CSF, 플라즈마, 포르말린 고정 파라핀 조직의 다양한 종류의 마이크로 RNA를 프로파일했다.

Introduction

마이크로 RNA는 이후 전사적으로 유전자 발현을 조절하는 RNA를 비 암호화 (길이 NT 21-23) 소규모의 가족에 속한다. 마이크로 RNA들이 비교적 안정적인 것으로 나타나는 세포 외 공간으로 분비 될 수있다. miRNA의 발현의 변화를 결정하는 miRNA의 프로파일을 수행하고 많은 양의 데이터를 처리, 생체 식별 향한 중요한 단계 일 수 있지만 위협 할 수있다.

여기, 우리는 민감한 실시간 PCR에 의한 (기타 체액에 적용) 뇌척수액에서의 miRNA 발현의 변화를 확인하기 위해 프로토콜을 설명합니다. 또한 통계 분석 결과의 그래픽 표현을 포함하여, 데이터 분석을위한 소프트웨어의 사용을 설명한다. 전체 절차는 비교적 쉽고 간단하며, 프로파일 및 실시간 PCR 기계의 수를 사용할 수 있습니다, 또한 상대적으로 빨리 할 수​​있는 샘플의 수에 따라 달라집니다. 실험 부분은 처리의 정확성을 필요로384 – 웰 플레이트에 RNA와 피펫, 제넥스를 사용하여 데이터 분석 섹션 정보학 및 통계의 몇 가지 기본 지식을 필요로하는 동안.

Protocol

다음 프로토콜은 준비 PCR 플레이트를 사용하여 CSF 및 프로필 마이크로 RNA에서 RNA를 분리하는 표준 절차를 설명합니다. 유기 상 추출은 선택 사항이며, 캐리어 RNA가 RNA의 최대 회수를 보장하는 동안 추출 시료에 첨가되어 있습니다. 결과적으로, RNA를 정량화 할 필요가 없다. cDNA를가 (약 2 시간) 전날 합성하면 전반적으로, 6 ~ 8 판의 평균 하루에 실행할 수 있습니다. 모든 샘플?…

Representative Results

이 연구 결과는 이전에 1 발표되었다. geNorm 응용 프로그램을 사용하여 후보 참조 마이크로 RNA의 분석 1은 결과를 그림. 따라서,이 마이크로 RNA, 미르 – 622 미르-1266은 표준 발현 유전자로서 식별하고, miRNA의 값을 정규화하기 위해 사용되었다. CSF의 연구를 위해 우리가 샘플의 세 그룹을했다 : HIV-(N = 10), HIVE 뇌염없이 (N = 4), 그리고…

Discussion

마이크로 RNA는 번역 억제 및 / 또는 mRNA의 분해 ^2를 촉진하여 유전자 발현을 조절하는 작은 비 암호화 RNA를합니다. 때문에 세포가없는 조건에서 높은 안정성, 마이크로 RNA는 많은 체액에서 검출되었다. 또한, 마이크로 RNA의 서로 다른 발현 양상은 인간의 암 ^3-9의 다양한 단계 및 / 또는 진행과 상관 관계가있다.

고전 칩 배열하거나 최신 깊은 시퀀싱 기술을 포?…

Materials

Table III. List of equipment

Equipment	Company	Catalog Number
Finnpipette Novus Multichannel Pipetter	Thermo Scientific	HH05279
Finntip Pipette Tips	Thermo Scientific	9400613
Thermal Cycler C1000	Biorad
0.2 ml Low Profile, Clear PCR tubes	Biorad	TLS0801
Flat Cap Strips	Biorad	TLS0803
LightCycler® 480 Real-Time PCR System	Roche
LightCycler® 480 Sealing Foil	Roche	04 729 757 001
Refrigerated Centrifuge 5804R	Eppendorf
Swing-bucket Rotor, 4-place	Eppendorf	A-4-44
Bench-Top Mini Centrifuge	Fisher	05-090-100
Bench-Top Vortex	Fisher
1.5 ml Microcentrifuge Tubes, Sterilized	Fisher	02-681-5
Matrix Reagent Reservoir, 25 ml	Thermo Scientific	8093
Thermomixer Confort	Eppendorf
Bench-To Mini Centrifuge Sigma 1-15	Sigma
Bench-Top Vortex	Velp Scientifica	F202A0173

Table IV. List of reagents

Reagents	Company	Catalog Number
Universal c-DNA synthesis kit, 16-32 rxns	Exiqon	203300
SYBR Green master mix, Universal RT, 25 ml	Exiqon	203400
Ultrapure Distilled Water Dnase, Rnase free	Invitrogen	10977-015
MicroRNA Ready to use PCR Human Panels (I+II) V2.R	Exiqon	203608
mirVana™ miRNA isolation Kit, 40 isolations	Ambion	AM1556
MS2 RNA carrier	Roche Applied Science	10165948001
2Betamercaptoethanol 98%	Sigma Aldrich	M3148-25ml
Ethanol 100%	Carlo Erba	64-17-5
Nuclease free water	Qiagen	1039480
RNAse Zap®	Ambion	AM9780