Liquido cerebrospinale MicroRNA profiling Utilizzando quantitativa Real Time PCR

Summary

Descriviamo un protocollo di PCR in tempo reale al profilo microRNA nel fluido cerebrospinale (CSF). Con l'eccezione di protocolli di estrazione di RNA, la procedura può essere estesa a RNA estratto da altri fluidi corporei, cellule coltivate, ei campioni di tessuto.

Abstract

MicroRNA (miRNA) costituiscono uno strato potente di regolazione genica guidando RISC a bersaglio siti posizionati su mRNA e, di conseguenza, modulando la loro repressione traduzionale. Cambiamenti nell'espressione miRNA hanno dimostrato di essere coinvolti nello sviluppo di tutte le principali malattie complesse. Inoltre, recenti scoperte hanno mostrato che i miRNAs possono essere secrete nell'ambiente extracellulare ed entrano nel flusso sanguigno e altri fluidi corporei dove possono circolare con elevata stabilità. La funzione di tale microRNA circolanti rimane in gran parte sfuggente, ma approcci sistematici ad alto rendimento, come miRNA array profiling, hanno portato all'identificazione di firme miRNA in diverse condizioni patologiche, tra cui le malattie neurodegenerative e alcuni tipi di tumori. In questo contesto, l'identificazione di miRNA profilo di espressione nel fluido cerebrospinale, come riportato nel nostro studio recente, rende miRNA candidati interessanti per analisi biomarker.

_content "> Ci sono diversi strumenti disponibili per il profiling microRNA, come microarrays, quantitativa real-time PCR (qPCR), e sequenziamento profondo. Qui, descriviamo un metodo sensibile al profilo microRNA nel fluido cerebrospinale dal quantitativa real-time PCR. noi utilizzato i pannelli umani Exiqon microRNA pronti per l'uso PCR I e II V2.R, che consente il rilevamento di 742 unici microRNA umani. Abbiamo eseguito gli array in un parchetto in triplicato e abbiamo elaborato e analizzato i dati utilizzando il software GenEx Professional 5.

Usando questo protocollo, abbiamo profilato successo microRNA in vari tipi di linee cellulari e cellule primarie, CSF, plasma e tessuti inclusi in paraffina fissati in formalina.

Introduction

MicroRNAs appartengono alla famiglia di piccole dimensioni (21-23 nt in lunghezza) RNA non codificanti che regolano l'espressione genica post-trascrizionale. microRNA possono essere secreti nello spazio extracellulare dove sembrano essere relativamente stabile. Mentre determinare cambiamenti nell'espressione miRNA può essere un passo importante verso l'identificazione di biomarcatori, eseguire profili miRNA e gestire una grande quantità di dati può essere intimidatorio.

Qui, descriviamo un protocollo per determinare cambiamenti nell'espressione miRNA nel liquido cerebrospinale (applicabile ad altri fluidi corporei) da un tempo reale sensibili PCR. Noi descriviamo anche l'uso di software per l'analisi dei dati, compresa l'analisi statistica e rappresentazione grafica dei risultati. L'intera procedura è relativamente semplice e lineare e, a seconda del numero di campioni da analizzare e il numero di macchine di PCR in tempo reale disponibili, anche relativamente veloce. La parte sperimentale richiede precisione nella movimentazioneRNA e pipettaggio in piastre da 384 pozzetti, mentre la sezione di analisi dei dati utilizzando GenEx richiede alcune conoscenze di base in informatica e statistica.

Protocol

Il protocollo che segue descrive la procedura standard per isolare RNA da CSF e di profilo microRNA utilizzando piastre PCR pronti. Si noti che l'estrazione fase organica è facoltativo, e che un RNA carrier viene aggiunta al campione durante l'estrazione garantire massimo recupero di RNA. Di conseguenza, non vi è alcuna necessità di quantificare l'RNA. Nel complesso, una media di 6-8 piastre può essere eseguito in un giorno se il cDNA viene sintetizzato il giorno prima (circa…

Representative Results

I risultati di questo studio sono stati pubblicati in precedenza 1. Figura 1 mostra i risultati dell'analisi dei microRNA riferimento candidati usando l'applicazione di geNorm. Di conseguenza, due microRNA, miR-622 e miR-1266, sono stati identificati i geni di riferimento e sono stati usati per normalizzare i valori di miRNA. Per lo studio QCS avevamo tre gruppi di campioni: da HIV (n = 10), HIVE (n = 4), e l'HIV +, senza encefalite (…

Discussion

MicroRNA sono piccoli RNA non codificanti che regolano l'espressione genica inibendo la traduzione e / o la promozione di degradazione dell'mRNA ^2. Grazie alla loro elevata stabilità in condizioni cell-free, microRNA sono stati rilevati in molti fluidi corporei. Inoltre, il profilo di espressione dei microRNA distinta è stata correlata con la fase e / o la progressione in una varietà di tumori umani ^3-9.

Ci sono diversi strumenti a disposizione al profilo mic…

Materials

Table III. List of equipment

Equipment	Company	Catalog Number
Finnpipette Novus Multichannel Pipetter	Thermo Scientific	HH05279
Finntip Pipette Tips	Thermo Scientific	9400613
Thermal Cycler C1000	Biorad
0.2 ml Low Profile, Clear PCR tubes	Biorad	TLS0801
Flat Cap Strips	Biorad	TLS0803
LightCycler® 480 Real-Time PCR System	Roche
LightCycler® 480 Sealing Foil	Roche	04 729 757 001
Refrigerated Centrifuge 5804R	Eppendorf
Swing-bucket Rotor, 4-place	Eppendorf	A-4-44
Bench-Top Mini Centrifuge	Fisher	05-090-100
Bench-Top Vortex	Fisher
1.5 ml Microcentrifuge Tubes, Sterilized	Fisher	02-681-5
Matrix Reagent Reservoir, 25 ml	Thermo Scientific	8093
Thermomixer Confort	Eppendorf
Bench-To Mini Centrifuge Sigma 1-15	Sigma
Bench-Top Vortex	Velp Scientifica	F202A0173

Table IV. List of reagents

Reagents	Company	Catalog Number
Universal c-DNA synthesis kit, 16-32 rxns	Exiqon	203300
SYBR Green master mix, Universal RT, 25 ml	Exiqon	203400
Ultrapure Distilled Water Dnase, Rnase free	Invitrogen	10977-015
MicroRNA Ready to use PCR Human Panels (I+II) V2.R	Exiqon	203608
mirVana™ miRNA isolation Kit, 40 isolations	Ambion	AM1556
MS2 RNA carrier	Roche Applied Science	10165948001
2Betamercaptoethanol 98%	Sigma Aldrich	M3148-25ml
Ethanol 100%	Carlo Erba	64-17-5
Nuclease free water	Qiagen	1039480
RNAse Zap®	Ambion	AM9780