Bioluminescent बैक्टीरिया का उपयोग रीयल टाइम में एक तीव्र माउस निमोनिया मॉडल में न्यूमोकोकल विषैलापन कारकों के प्रभाव के बाद
Summary
स्ट्रैपटोकोकस निमोनिया गंभीर समुदाय का अधिग्रहण निमोनिया और दुनिया भर में 2 लाख से अधिक मौतों के लिए जिम्मेदार के कारण प्रमुख रोगज़नक़ है. फिटनेस या डाह में फंसा बैक्टीरियल कारकों के प्रभाव bioluminescent बैक्टीरिया का उपयोग कर एक तीव्र माउस निमोनिया या bacteremia मॉडल में वास्तविक समय में निगरानी की जा सकती है.
Abstract
निमोनिया के विकास में प्रमुख स्वास्थ्य देखभाल की समस्याओं और औद्योगिक देशों में से एक है और काफी रुग्णता और मृत्यु दर के साथ जुड़ा हुआ है. इस बीमारी का ज्ञान, गहन चिकित्सा इकाई (आईसीयू) की उपलब्धता, और शक्तिशाली रोगाणुरोधी एजेंटों और प्रभावी टीके के प्रयोग में प्रगति के बावजूद, मृत्यु दर 1 अधिक रहती है. स्ट्रैपटोकोकस निमोनिया समुदाय का अधिग्रहण निमोनिया के प्रमुख रोगज़नक़ (कैप) है और मनुष्यों में bacteremia का सबसे सामान्य कारणों में से एक. इस रोगज़नक़ सतह उजागर adhesins और निमोनिया और आक्रामक न्यूमोकोकल रोग (आईपीडी) के लिए योगदान विषैलापन कारकों में से एक साधन के साथ सुसज्जित है. बैक्टीरियल फिटनेस या विषैलापन कारकों के vivo भूमिका का आकलन एस को जानने के लिए अत्यंत महत्वपूर्ण है निमोनिया pathogenicity तंत्र. निमोनिया, bacteremia, और दिमागी बुखार के murine मॉडल अलग पर न्यूमोकोकल कारकों के प्रभाव को निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया जा रहा हैसंक्रमण के चरणों अलग. यहाँ हम intranasal या bioluminescent बैक्टीरिया के साथ intraperitoneal संक्रमण के बाद चूहों में वास्तविक समय न्यूमोकोकल प्रसार में नजर रखने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन. परिणाम एक इमेजिंग प्रणाली और साथ विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग कल्पना और मूल्यांकन किया जा सकता है, जो कम श्वसन तंत्र और रक्त में गुणन और pneumococci के प्रसार, दिखाते हैं.
Introduction
वायरस या बैक्टीरिया की वजह से श्वसन तंत्र में संक्रमण दुनिया भर में सभी की मौत का लगभग एक तिहाई के कारण दुनिया भर में सबसे आम समुदाय उपार्जित या नैदानिक समस्याओं के रहते हैं. कुंजी बैक्टीरियल प्रजातियों हेमोफिलस इन्फ्लुएंजा और स्ट्रैपटोकोकस निमोनिया 2 हैं. हालांकि, इन प्रजातियों के जीवाणु सामान्य रूप से प्राकृतिक श्वसन तंत्र वनस्पति के आम घटक हैं. इस प्रकार बैक्टीरियल गाड़ी आक्रामक रोग और प्रतिरक्षा स्थिति या व्यक्तियों के predispositions पर निर्भर करता है के लिए कुछ जोखिम का भी है. स्पर्शोन्मुख बसाना आक्रामक संक्रमण के लिए शुरू हो रहा है. स्ट्रैपटोकोकस निमोनिया समुदाय का अधिग्रहण निमोनिया (कैप) और मानव में bacteremia का सबसे सामान्य कारणों में से एक के प्रमुख रोगज़नक़ है. स्वस्थ व्यक्तियों में एस निमोनिया (pneumococci) अक्सर वे nonpathogenic बैक्टीरिया के साथ सामना कर रहे हैं, जहां ऊपरी श्वास नलिका, का स्पर्शोन्मुख और हानिरहित उपनिवेशवादियों हैंलेकिन ऐसे भी हेमोफिलस एसपीपी के रूप में रोगजनकों के साथ निवासी वनस्पतियों की. या Staphylococcus aureus और मानव प्रतिरक्षा रक्षा प्रणाली की पहली पंक्ति. कैरिज दरों छोटे बच्चों में सबसे अधिक हैं (37%) और 3-5 (58%) भीड़ दिन देखभाल केंद्रों के भीतर भी अधिक है. सबसे कम उम्र की आबादी और बुजुर्ग, वाहक और nasopharyngeal स्राव 6 से एयरोसोल प्रसारण के जरिए pneumococcus प्राप्त, न्यूमोकोकल संयुग्म टीके (वयस्कों में बच्चों और 23-valent polysaccharide PPSV23 में PCV10 या PCV13) में से एक का उपयोग उच्च जोखिम वाले समूहों और टीकाकरण के हैं संयुक्त राज्य अमेरिका (अमेरिका) और कई यूरोपीय देशों 4 में सिफारिश की है. PCVs बच्चों में सबसे अधिक प्रचलित सीरमप्रकारों कवर जबकि PPSV23, वयस्कों में इस प्रकार कुशलता से आक्रामक न्यूमोकोकल रोग (आईपीडी) को रोकने के अमेरिका और यूरोप में bacteremic न्यूमोकोकल रोग, के 90% ~ के लिए जिम्मेदार सीरमप्रकारों को शामिल किया गया. नतीजतन, आईपीडी कारण वैक्सीन प्रकार (वीटी) को redu हैंएक उच्च डाह क्षमता और एंटीबायोटिक प्रतिरोध प्रदर्शित CED लेकिन nonvaccine सीरमप्रकारों 4,7-12 उभरा है. जलाशय के रूप में nasopharynx हानिकारक स्थानीय संक्रमण की शुरुआत साइनस या मध्य कान में फैल pneumococci के लिए प्रारंभ बिंदु है. जीवन के लिए खतरा कैप 4,13 में जिसके परिणामस्वरूप ब्रोन्किया और फेफड़ों को airway के माध्यम से सीधे फैल अधिक महत्वपूर्ण है, pneumococci. फेफड़ों में संक्रमण अक्सर इस प्रकार रक्त में प्रसार करने के लिए रोगज़नक़ सक्षम और आईपीडी, जिससे ऊतक और बाधा विनाश के साथ साथ कर रहे हैं. कैप और आईपीडी की घटनाओं immunocompromised व्यक्तियों में या उम्र 4,13 के चरम पर सबसे अधिक हैं. उच्च डाह के साथ एक रोगाणु एक खानेवाला से रूपांतरण के लिए जिम्मेदार परिस्थितियों बहस के तहत अब भी कर रहे हैं. हालांकि, उच्च डाह और एंटीबायोटिक प्रतिरोध में वृद्धि के साथ साथ मेजबान संवेदनशीलता और विकासवादी अनुकूलन में परिवर्तन के अलावा PNE पर एक महत्वपूर्ण प्रभाव पड़ता है सुझाव दिया गया हैumococcal संक्रमण 14-16.
रोगज़नक़ उपकला कोशिकाओं mucosal को घनिष्ठ संपर्क में मध्यस्थता adhesins की बहुलता के साथ संपन्न है. Airway बलगम surmounting के बाद, कोशिकाओं की मेजबानी के लिए न्यूमोकोकल पालन सेलुलर रिसेप्टर्स के साथ सतह उजागर adhesins का प्रत्यक्ष बातचीत के माध्यम से और अणुओं 4,17,18 सेतु के रूप में बाह्य मैट्रिक्स घटकों या सीरम प्रोटीन शोषण से मदद की है. के रूप में बहुमुखी रोगजनकों pneumococci भी मेजबान प्रतिरक्षा सुरक्षा तंत्र की चोरी में शामिल घटकों के साथ सुसज्जित हैं. इसके अलावा, वे इस तरह के क्रमशः फेफड़े, रक्त, और मस्तिष्कमेरु द्रव (सीएसएफ), 5,17,19,20 के रूप में विभिन्न मेजबान milieus के लिए अनुकूल करने की क्षमता है.
रोगजनन और भड़काऊ मेजबान प्रतिक्रियाओं पर बैक्टीरियल कारकों के प्रभाव को निमोनिया, bacteremia की प्रयोगात्मक पशु मॉडल में जांच की, या 21-25 मैनिंजाइटिस है. एक मानव रोगज़नक़ होने के बावजूद, इन मॉडलों हम कर रहे हैंन्यूमोकोकल ऊतक tropism, डाह तंत्र, या न्यूमोकोकल वैक्सीन उम्मीदवारों की protectivity समझने के लिए करूँगा की स्थापना की. जन्मजात माउस उपभेदों के आनुवंशिक पृष्ठभूमि pneumococci के लिए संवेदनशीलता को निर्धारित करता है. CBA / सीए और SJL चूहों न्यूमोकोकल संक्रमण 22 लोगों के खिलाफ अधिक अतिसंवेदनशील थे जबकि intranasally pneumococci से संक्रमित BALB / ग चूहों, प्रतिरोधी होना पाया गया है. यह मनुष्य, आनुवंशिक पृष्ठभूमि और मेजबान सुरक्षा तंत्र के लिए इसी तरह के संक्रमण के परिणाम तय, कि निकलता है. इसलिए, आगे प्रयास न्यूमोकोकल संक्रमण को कम अतिसंवेदनशील चूहों के जीनोम में प्रतिरोध स्थलों को जानने के लिए आवश्यक हैं. निष्कर्ष में विवो डाह प्रोटोकॉल में परिवर्तन भी आया है. इसके बजाय अक्सर अतीत में इस्तेमाल जन्मजात BALB / ग चूहों की, अत्यधिक अतिसंवेदनशील CD-1/MF1 outbred माउस उपभेदों आजकल अक्सर नुकसान के समारोह न्यूमोकोकल डाह या फिटनेस 26-28 कारकों के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए उपयोग किया जाता है. इसके अलावा, उपलब्धताbioluminescent pneumococci और ऑप्टिकल इमेजिंग तकनीक के संक्रमण की वास्तविक समय bioluminescence bioimaging अनुमति देता है. Pneumococci में अनुकूलित luxABCDE जीन कैसेट (प्लाज्मिड पॉल एक TN 4001 luxABCDE किमी नि.) transposon mutagenesis के द्वारा गुणसूत्र का एक भी एकीकरण साइट में डाला गया है. Bioluminescent pneumococci डाह या फिटनेस कारकों और एक अन्य 26,28-31 के लिए एक संरचनात्मक साइट से उनके स्थानान्तरण में कमी न्यूमोकोकल म्यूटेंट की क्षीणन का आकलन करने के लिए नियोजित किया गया है.
यहाँ हम एक murine निमोनिया या पूति मॉडल में न्यूमोकोकल संक्रमण के bioimaging के लिए एक प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं. Intranasally या intraperitoneally संक्रमित चूहों में प्रवर्धन और bioluminescent pneumococci के प्रसार को आसानी से अलग समय बिंदुओं पर एक ऑप्टिकल इमेजिंग सिस्टम और एक ही जानवर का उपयोग कर समय पर नजर रखी जा सकती है.
Protocol
Representative Results
Discussion
पशुओं में आयोजित सभी प्रयोगों स्थानीय अधिकारियों और नैतिकता आयोग द्वारा अनुमोदित किया जाना है. Vivo में संक्रमण प्रयोगों में संक्रमित पशुओं की विभिन्न मेजबान आलों में बैक्टीरियल लोड विभिन्न समय …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
प्रयोगशाला में अनुसंधान एसएच लिए ड्यूश Forschungsgemeinschaft (DFG हा 3125/3-2, DFG हा 3125/4-2) और शिक्षा और अनुसंधान के संघीय मंत्रालय (BMBF) मेडिकल संक्रमण जीनोमिक्स (FKZ 0315828A) से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया.
Materials
| Todd Hewitt broth | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | X936.1 | |
| Yeast extract | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 2363.2 | |
| Blood agar plates | Oxoid, Wesel, Germany | PB5039A | |
| Kanamycin | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | T832.2 | |
| Erythromycin | Sigma-Aldrich,Taufkirchen, Germany | E6376 | |
| fetal bovine serum (FBS) | PAA Laboratories, Coelbe, Germany | A11-151 | |
| CD-1 mice, female | Charles River, Sulzfeld, Germany | CD1SIFE06W08W | female CD-1 mice, six to eight weeks old |
| Ketamin 500mg, Curamed injection solution | Schwabe-Curamed, Karlsruhe, Germany | ||
| Rompun 2%, injection solution | Bayer Animal Health, Monheim, Germany | ||
| BD Plastipak 1 ml syringes | Becton Dickinson, Heidelberg, Germany | 300015 | sterile Luer-Lok™ syringes with needle |
| Gel Loader Tips | peqlab | 81-13790 | MµltiFlex™ Tips |
| Hyaluronidase | Sigma-Aldrich | H3884-100mg | Hyaluronidase Type IV-S from Bovine test |
| Oxygen | Air Liquide, Düsseldorf, Germany | M1001L50R2A001 | |
| Isofluoran | Baxter, Unterschleißheim, Germany | ||
| pGEM-T Easy | Promega, Mannheim, Germany | ||
| Oligonucleotides | Eurofins MWG, Ebersberg, Germany | ||
| Qiaprep Spin Midiprep Kit | Qiagen, Hilden, Germany | 27104 | |
| PCR DNA purification kit | Qiagen, Hilden, Germany | 28106 | |
| Equipment | |||
| Living Image 4.1 software | Caliper Life Sciences/PerkinElmer, Rodgau, Germany | ||
| XGI-8 Gas Anesthesia System | Caliper Life Sciences/PerkinElmer, Rodgau, Germany | ||
| IVIS Spectrum Imaging System | Caliper Life Sciences/PerkinElmer, Rodgau, Germany | ||
| Biophotometer | Eppendorf AG, Hamburg, Germany |
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