생물 발광 박테리아를 사용하여 실시간으로 급성 폐렴 마우스 모델에서 폐렴 구균 독성 요인의 영향에 따라
Summary
폐렴 구균은 중증 지역 사회 획득 폐렴과 전 세계적으로 2 백만 이상의 죽음에 책임을 일으키는 주요 병원균이다. 적합성 또는 병독성에서 내포 세균성 요인의 영향은 생물 발광 박테리아를 이용한 급성 마우스 폐렴이나 균혈증 모델에서 실시간으로 모니터링 할 수있다.
Abstract
폐렴 개발의 주요 건강 문제와 선진국 중 하나이며 상당한 이환율 및 사망률과 관련이 있습니다. 이 질병의 지식, 중환자 실 (ICU)의 가용성, 강력한 항균제하고 효과적인 백신의 사용의 발전에도 불구하고, 사망률은 1 높은 수준으로 유지. 폐렴 구균은 지역 사회 획득 폐렴의 주요 원인균 (CAP)입니다 인간의 균혈증의 가장 흔한 원인 중 하나. 이 병원체는 표면에 노출 된 adhesins 폐렴 및 침습성 폐렴 구균 질환 (IPD)에 기여 독성 요인의 armamentarium에 장착되어 있습니다. 세균의 적합성 또는 독성 인자의 생체 내 역할의 평가는 S.를 해결하는 것을 가장 중요합니다 폐렴 병원성 메커니즘. 폐렴, 균혈증 및 뇌막염 뮤린 모델 DIF에서 폐렴 구균 성 요인의 영향을 결정하기 위하여 사용되고감염의 단계를 ferent. 여기에서 우리는 비강 또는 생물 발광 박테리아와 복강 내 감염 후 마우스에서 실시간으로 폐렴 구균 보급에 모니터링하는 프로토콜을 설명합니다. 결과는 묘화 시스템 및 첨부 된 분석 소프트웨어를 사용하여 시각 및 평가 될 수 하부 호흡기 및 혈액에서 곱셈과 폐렴 구균의 확산을 보여준다.
Introduction
바이러스 나 세균에 의한 호흡기 감염은 전세계의 모든 사망의 약 삼분의 원인이 전 세계적으로 가장 일반적인 지역 사회 획득 임상 문제 중 하나가 남아있다. 키 세균 종은 헤 모필 러스 인플루엔자 및 폐렴 구균이 있습니다. 그러나 이러한 세균 종은 일반적으로 자연 호흡기 식물의 일반적인 성분이다. 따라서 세균 마차 침략 질환과 면역 상태 나 개인의 성향에 따라에 대한 특정 위험에 있습니다. 증상이 식민지는 침략적인 감염에 트리거됩니다. 폐렴 구균은 지역 사회 획득 폐렴 (CAP)과 인간의 균혈증의 가장 흔한 원인 중 하나의 주요 원인균이다. 건강한 사람의 S. 폐렴 (폐렴 구균)는 종종 그들이 비병원성 박테리아에 직면 상부 호흡기의 증상 및 무해 식민지 개척자이다뿐만 아니라, 헤 모필 러스 종으로 병원균 상주 식물의. 또는 포도상 구균 및 인간의 면역 방어 체계의 첫번째 줄. 운송 요금은 어린이에서 가장 높은 (37 %)과 3-5 (58 %) 붐비는 보육 시설 내에서 더 높은. 젊은 인구와 노인, 사업자 및 비 인두 분비물 6에서 에어로졸 전송을 통해 폐렴을 받고, 폐렴 구균 결합되는 백신 (성인 어린이와 23 가의 다당류 PPSV23에서 PCV10이나 PCV13) 중 하나를 사용하여 위험이 높은 그룹과 예방 접종에 속하지 미국 (미국)과 많은 유럽 국가 4 추천합니다. PCVs 어린이에서 가장 널리 혈청 형을 포함하는 동안 PPSV23는, 성인에 따라서 효율적으로 침습성 폐렴 구균 질환 (IPD)을 방지하는 미국과 유럽의 bacteremic 폐렴 구균 질환의 90 % ~에 대한 책임 혈청 형을 포함한다. 결과적으로, IPD 인해 백신 유형 (VT)에 redu은높은 독성의 가능성과 항생제 내성을 표시 CED하지만 nonvaccine 혈청 형은 4,7-12을 등장했습니다. 저수지 인두 유해 지역 감염을 시작하는 부비동 또는 중간 귀를 확산 폐렴 구균의 출발점입니다. 생명을 위협하는 CAP 4,13의 결과로 기관지 및 폐에기도를 통해 직접 전파 더 중요한 것은, 폐렴 구균. 폐 감염은 종종 이렇게 혈액으로 확산 병원체를 활성화하고 IPD의 원인, 조직과 장벽의 파괴와 함께 제공됩니다. CAP 및 IPD의 발생 빈도는 면역 사람의 나이 4,13의 극단에서 가장 높다. 높은 독성을 가진 병원체에 공생의 변환을 담당하는 상황이 논쟁에서 아직도있다. 그러나, 높은 독성 항생제 저항의 증가와 함께 동반 호스트 감수성과 진화 적응의 변화 외에 PNE에 중요한 영향을 미칠 것으로 제안되었다umococcal 감염 14-16.
병원체는 상피 세포 점막 친밀한 접촉을 매개 adhesins의 다양성을 부여한다. 기도 점액을 극복 한 후, 세포를 호스팅하는 폐렴 구균 준수는 세포 수용체와 표면에 노출 된 adhesins의 직접적인 상호 작용을 통해 분자에게 4,17,18 가교로서 세포 외 기질의 구성 요소 또는 혈청 단백질을 이용하여 용이하게된다. 등의 다양한 병원체 폐렴 구균은 숙주 면역 방어 메커니즘의 회피에 관련된 요소를 갖추고 있습니다. 또한, 그들은 이러한 각각 폐, 혈액 및 뇌척수액 (CSF), 5,17,19,20와 같은 다양한 호스트 milieus에 적응하는 능력이있다.
발병 기전과 염증 호스트 반응에 세균 요인의 영향은 폐렴, 균혈증의 실험 동물 모델에서 조사, 또는 21-25 뇌막염됩니다. 인간의 병원체에도 불구하고,이 모델은 우리입니다폐렴 구균 조직의 굴곡 운동, 독성 메커니즘, 또는 폐렴 구균 백신 후보의 보호도를 해독 LL 설립. 근친 마우스 종자의 유전 적 배경은 폐렴 구균에 감수성을 결정한다. CBA / CA와 SJL 생쥐는 폐렴 구균 감염 (22)에 대해 더 민감 동안 비강 폐렴 구균에 감염된 BALB / c 마우스는, 저항하는 것으로 밝혀졌다. 이것은 인간 유전 배경 및 숙주 방어 메카니즘과 유사한이 감염의 결과를 결정한다는 것을 의미한다. 따라서, 더 노력이 폐렴 구균 감염에 덜 민감 쥐의 게놈에 저항 궤적을 해명 할 필요합니다. 연구 결과는 생체 내 독성 프로토콜의 변화를 이끌고있다. 대신 종종 과거에 사용 근친 BALB / c 마우스의, 매우 민감 CD-1/MF1 비근 교계 마우스 종자는 요즘 종종 기능 상실 폐렴 구균 독성의 적합성에 26-28 요인의 효과를 연구하는 데 사용됩니다. 또한, 가용성생물 발광 폐렴 구균 및 광학 이미징 기술의 감염의 실시간 생물 발광 및 bioimaging는 허용한다. 폐렴 구균에 최적화 luxABCDE 유전자 카세트 (플라스미드 폴-A 테네시 luxABCDE 4001 km의 R)는 트랜스포존 돌연변이 유발에 의한 염색체의 단일 통합 부위에 삽입되었다. 생물 발광 폐렴 구균은 독성의 적합성 요인과 다른 26,28-31 한 해부 사이트에서 자신의 전위 결핍 된 폐렴 구균 돌연변이 체의 감쇠를 평가하기 위해 사용되었다.
여기에서 우리는 쥐의 폐렴이나 패혈증 모델에서 폐렴 구균 감염의 및 bioimaging위한 프로토콜을 제공합니다. 비강 내 또는 복강 내 감염 생쥐의 증폭 및 생물 발광 폐렴 구균의 보급이 용이하게 상이한 시점에서 광학 이미징 시스템과 같은 동물을 사용하여 시간에 걸쳐 모니터링 될 수있다.
Protocol
Representative Results
Discussion
동물에서 실시한 모든 실험은 지역 당국과 윤리위원회의 승인을 받아야합니다. 생체 내 감염 실험에서 감염된 동물의 다양한 호스트 틈새에 세균 부하는 다양한 시점 후 감염에서 결정되어야한다. 이러한 실험 조건 하에서 동물은 종래의 혈액, 인두, bronchoalvelar 세척, 또는 폐, 비장, 뇌 등의 장기에서 박테리아의 분리에 희생되어야한다. 호스트 틈새 당 세균 수를 계산하고 병원성…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
실험실에서 연구 SH에 도이치 Forschungsgemeinschaft (DFG HA 3125/3-2, DFG HA 3125/4-2) 및 교육과 연구의 연방 교육부 (BMBF) 의료 감염 유전체학 (FKZ 0315828A)에서 교부금에 의해 지원되었다.
Materials
| Todd Hewitt broth | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | X936.1 | |
| Yeast extract | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 2363.2 | |
| Blood agar plates | Oxoid, Wesel, Germany | PB5039A | |
| Kanamycin | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | T832.2 | |
| Erythromycin | Sigma-Aldrich,Taufkirchen, Germany | E6376 | |
| fetal bovine serum (FBS) | PAA Laboratories, Coelbe, Germany | A11-151 | |
| CD-1 mice, female | Charles River, Sulzfeld, Germany | CD1SIFE06W08W | female CD-1 mice, six to eight weeks old |
| Ketamin 500mg, Curamed injection solution | Schwabe-Curamed, Karlsruhe, Germany | ||
| Rompun 2%, injection solution | Bayer Animal Health, Monheim, Germany | ||
| BD Plastipak 1 ml syringes | Becton Dickinson, Heidelberg, Germany | 300015 | sterile Luer-Lok™ syringes with needle |
| Gel Loader Tips | peqlab | 81-13790 | MµltiFlex™ Tips |
| Hyaluronidase | Sigma-Aldrich | H3884-100mg | Hyaluronidase Type IV-S from Bovine test |
| Oxygen | Air Liquide, Düsseldorf, Germany | M1001L50R2A001 | |
| Isofluoran | Baxter, Unterschleißheim, Germany | ||
| pGEM-T Easy | Promega, Mannheim, Germany | ||
| Oligonucleotides | Eurofins MWG, Ebersberg, Germany | ||
| Qiaprep Spin Midiprep Kit | Qiagen, Hilden, Germany | 27104 | |
| PCR DNA purification kit | Qiagen, Hilden, Germany | 28106 | |
| Equipment | |||
| Living Image 4.1 software | Caliper Life Sciences/PerkinElmer, Rodgau, Germany | ||
| XGI-8 Gas Anesthesia System | Caliper Life Sciences/PerkinElmer, Rodgau, Germany | ||
| IVIS Spectrum Imaging System | Caliper Life Sciences/PerkinElmer, Rodgau, Germany | ||
| Biophotometer | Eppendorf AG, Hamburg, Germany |
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