Summary

Nach der in Echtzeit die Auswirkungen der Pneumokokken-Virulenzfaktoren in einer akuten Lungenentzündung Maus-Modells mit Biolumineszenz-Bakterien

Published: February 23, 2014
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Summary

Streptococcus pneumoniae ist der führende Erreger schwerer ambulant erworbener Pneumonie und für mehr als 2 Millionen Todesfälle weltweit verantwortlich. Die Auswirkungen der bakteriellen Faktoren in Fitness-oder Virulenz beteiligt können in Echtzeit in einer akuten Lungenentzündung oder Bakteriämie Maus-Modell mit Biolumineszenz-Bakterien beobachtet werden.

Abstract

Lungenentzündung ist eine der wichtigsten Gesundheitsprobleme in Entwicklungsländern und Industrieländern und ist mit erheblichen Morbidität und Mortalität verbunden. Trotz der Fortschritte in Kenntnis dieser Krankheit, die Verfügbarkeit von Intensivstationen (ICU), und der Einsatz von potenten antimikrobielle Mittel und wirksame Impfstoffe, bleiben die Sterblichkeit hoch ein. Streptococcus pneumoniae ist der führende Erreger der ambulant erworbenen Pneumonie (CAP) und eine der häufigsten Ursachen von Bakteriämie bei Menschen. Dieser Erreger ist mit einem Arsenal von oberflächenexponierten Adhäsine und Virulenz Faktoren, die zu einer Lungenentzündung und invasive Pneumokokken-Erkrankungen (IPD) ausgestattet. Die Bewertung der in-vivo-Rolle von bakteriellen Virulenzfaktoren Fitness oder ist von größter Bedeutung, S. entwirren pneumoniae Pathogenität Mechanismen. Murine Modelle von Pneumonie, Bakteriämie, und Meningitis werden eingesetzt, um die Auswirkungen der Pneumokokken-Faktoren zu bestimmen, verschiedenen Stadien der Infektion. Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Überwachung in Echtzeit Pneumokokken-Verbreitung in Mäusen nach intranasaler oder intraperitoneale Infektionen mit Biolumineszenz-Bakterien. Die Ergebnisse zeigen die Vermehrung und Verbreitung von Pneumokokken in die unteren Atemwege und Blut, die visualisiert und ausgewertet werden kann mit Hilfe eines Imaging-System und die dazugehörige Analyse-Software.

Introduction

Infektionen der Atemwege, die durch Viren oder Bakterien verursacht weiterhin eine der häufigsten ambulant erworbenen oder klinische Probleme verursachen etwa ein Drittel aller weltweit Todesursache weltweit. Die wichtigsten Bakterienarten sind Haemophilus influenzae und Streptococcus pneumoniae 2. Allerdings sind diese Bakterienarten in der Regel übliche Bestandteile der natürlichen Atemwege Flora. Somit ist die bakterielle Schlitten auch gewisse Gefahr einer invasiven Erkrankung und je nach der Immunstatus oder Prädispositionen der Individuen. Die asymptomatischen Besiedlung auf invasive Infektionen ausgelöst. Streptococcus pneumoniae ist der führende Erreger der ambulant erworbenen Pneumonie (CAP) und eine der häufigsten Ursachen von Bakteriämie bei Menschen. Bei gesunden Personen S. pneumoniae (Pneumokokken) sind oft asymptomatisch und harmlos Kolonisatoren der oberen Atemwege, wo sie mit nicht-pathogener Bakterien gegender ansässigen Flora, sondern auch mit Erregern wie Haemophilus spp. oder Staphylococcus aureus und die erste Zeile des menschlichen Immunabwehr. Wagen am höchsten sind bei jungen Kindern (37%) und sogar noch höher im überfüllten Tagesstätten (58%) 3-5. Die jüngste Bevölkerung und ältere Menschen, Erhalt der Pneumokokken über Aerosol-Übertragung von Nasen-Rachen-Sekrete Träger und 6, gehören zu den Risikogruppen und die Impfung mit einem der Pneumokokken-Konjugat-Impfstoffe (PCV10 oder PCV13 bei Kindern und 23-valenten Polysaccharid PPSV23 bei Erwachsenen) ist in den Vereinigten Staaten (US) und vielen europäischen Ländern 4 empfohlen. Die PPSV23 deckt Serotypen für ~ 90% der Pneumokokken-Bakteriämie Krankheiten in den USA und Europa, so effizient verhindert invasive Pneumokokken-Erkrankungen (IPD) bei Erwachsenen verantwortlich, während die PCV decken die häufigsten Serotypen bei Kindern. Folglich durch Impfstoff-Typen (VT) sind IPD reduced aber nonvaccine Serotypen Anzeige eine hohe Virulenz Potenzial und die Antibiotika-Resistenz haben 4,7-12 entstanden. Der Nasenrachenraum als Reservoir ist der Ausgangspunkt für Pneumokokken zu den Nasennebenhöhlen oder Mittelohr Einleitung schädlicher lokaler Infektionen verbreiten. Noch wichtiger ist, Pneumokokken direkt über die Atemwege bis zu den Bronchien und der Lunge, was zu lebensbedrohlichen CAP 4,13 verbreiten. Lungenentzündungen sind oft mit Gewebe-und Barriere Zerstörung begleitet, so dass die Erreger in die Blut verbreitet und verursacht IPD. Inzidenz von GAP und IPD höchsten sind bei immungeschwächten Personen oder an den Extremen der Alters 4,13. Die für die Umwandlung von einem kommen auf einen Erreger mit hoher Virulenz verantwortlich Umstände sind noch immer umstritten. Doch neben Veränderungen in der Wirtsempfindlichkeit und evolutionäre Anpassung begleitet mit höheren Virulenz und die Zunahme der Antibiotika-Resistenzen wurden vorgeschlagen, um einen entscheidenden Einfluss auf pne habenumococcal Infektionen 14-16.

Der Erreger ist mit einer Vielzahl von Adhäsine Vermittlung innigem Kontakt an Epithelzellen der Schleimhaut dotiert. Nach Überwindung der Atemwege Schleim, ist die Einhaltung Pneumokokken an Wirtszellen über direkte Interaktionen der Oberfläche exponierte Adhäsine mit zellulären Rezeptoren und durch die Nutzung extrazellulären Matrixkomponenten oder Serumproteine ​​als Brückenmoleküle 4,17,18 erleichtert. So vielseitig Erreger Pneumokokken sind auch mit Faktoren in Umgehung der Immunabwehr beteiligten Mechanismen ausgestattet. Darüber hinaus haben sie die Fähigkeit, sich an verschiedene Wirts Milieus wie der Lunge, Blut und Rückenmarksflüssigkeit (CSF), jeweils 5,17,19,20 anzupassen.

Die Auswirkungen der bakteriellen Faktoren auf die Pathogenese und entzündlichen Wirtsreaktionen in experimentellen Tiermodellen der Pneumonie, Bakteriämie sucht oder Meningitis 21-25. Obwohl er ein humanes Pathogen, wir sind diese Modellell-gegründet, um Pneumokokken Gewebetropismus, Virulenz Mechanismen oder Protektivität der Pneumokokken-Impfstoff-Kandidaten zu entziffern. Der genetische Hintergrund des Inzucht-Mausstämmen bestimmt die Empfindlichkeit gegen Pneumokokken. BALB / c-Mäuse intranasal mit Pneumokokken infiziert waren resistent zu sein, während CBA / Ca und SJL-Mäuse waren empfindlich gegen Pneumokokken-Infektionen 22. Dies impliziert, dass, ähnlich wie beim Menschen, den genetischen Hintergrund und die Abwehrmechanismen des Wirts zu bestimmen, das Ergebnis der Infektion. Daher sind weitere Anstrengungen erforderlich, um den Widerstand Loci im Genom der Mäuse weniger anfällig für Pneumokokken-Infektionen zu entwirren. Die Ergebnisse wurden auf Veränderungen in vivo Virulenz Protokolle geführt. Anstelle der Inzucht BALB / c-Mäuse in der Vergangenheit oft verwendet, werden die sehr anfällig CD-1/MF1 outbred Mausstämme heutzutage oft verwendet, um die Wirkung von loss-of-function Pneumokokken Virulenz oder Fitness Faktoren 26-28 studieren. Darüber hinaus ist die Verfügbarkeitbiolumineszierender Pneumokokken und optischen Bildgebungsverfahren ermöglicht die Echtzeit-Biolumineszenz bioimaging von Infektionen. In Pneumokokken die optimierte luxABCDE Gen-Kassette (Plasmid Paul-A Tn 4001 luxABCDE Km r) hat sich zu einem einzigen Integrationsstelle des Chromosoms durch Transposon-Mutagenese eingeführt worden ist. Biolumineszenz Pneumokokken wurden eingesetzt, um die Dämpfung des Pneumokokken-Mutanten in der Virulenz oder Fitness-Faktoren und ihre Translokation von einem zu einem anderen anatomischen Ort 26,28-31 mangelhaft zu beurteilen.

Hier stellen wir ein Protokoll für die bioimaging der Pneumokokken-Infektionen in einem Maus-Pneumonie oder Sepsis-Modell. Amplifikation und Verbreitung von Biolumineszenz Pneumokokken in intranasal oder intraperitoneal infiziert Mäuse leicht mit der Zeit unter Verwendung eines optischen Abbildungssystems und des gleichen Tieres zu verschiedenen Zeitpunkten beobachtet werden.

Protocol

Die hier beschriebenen Tierinfektionsversuche müssen in strikter Übereinstimmung mit den örtlichen und internationalen (zB Europäische Gesundheitsgesetz des Bundes für Labortierkunde Verbände (FELASA)) Richtlinien und Vorschriften für den Einsatz von Wirbeltieren durchgeführt werden. Die Versuche müssen von der lokalen ethischen Pension und Institutional Animal Care Committee genehmigt werden. Alle Experimente mit S. pneumoniae im Labor oder Tierinfektionen sind in einer Klasse II Biosicherhei…

Representative Results

Der Erwerb und die Aufnahme von Methionin ist von zentraler Bedeutung für Pneumokokken zu Fitness in ihren Gast Nische 32,33 zu erhalten. Die Methionin-ABC-Transporter-Lipoprotein in D39 von der SPD _ 0151 Gen (TIGR4: sp_0149) codiert und nannte MetQ 32. Pneumokokken weiter produzieren Methionin-Biosynthese-Enzyme (D39: Spd_0510 – Spd_0511; TIGR4 Sp_0585 – Sp_0586, Mete und metF). Das Fehlen von Methionin in einem chemisch definierten Medium beeinflusst das Wachstum von …

Discussion

Alle Versuche an Tieren durchgeführt haben, die von den lokalen Behörden und Ethikkommissionen genehmigt werden. Bei in vivo Experimenten ist die Infektion bakterielle Belastung in den verschiedenen Wirtsnischen der infizierten Tiere zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Infektion bestimmt. Unter diesen experimentellen Bedingungen die Tiere, die vor der Trennung der Bakterien aus dem Blut, des Nasopharynx, bronchoalvelar Spülung oder Organen wie der Lunge, Milz und Gehirn geopfert werden. Um die Anzahl…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Forschung im Labor wurde durch Zuschüsse der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG HA 3125/3-2, DFG HA 3125/4-2) und dem Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF) Medical Genomics Infektion (FKZ 0315828A) SH unterstützt.

Materials

Todd Hewitt broth Carl Roth, Karlsruhe, Germany X936.1
Yeast extract Carl Roth, Karlsruhe, Germany 2363.2
Blood agar plates Oxoid, Wesel, Germany PB5039A
Kanamycin Carl Roth, Karlsruhe, Germany T832.2
Erythromycin Sigma-Aldrich,Taufkirchen, Germany E6376
fetal bovine serum (FBS) PAA Laboratories, Coelbe, Germany A11-151
CD-1 mice, female Charles River, Sulzfeld, Germany CD1SIFE06W08W female CD-1 mice, six to eight weeks old
Ketamin 500mg, Curamed injection solution Schwabe-Curamed, Karlsruhe, Germany
Rompun 2%, injection solution Bayer Animal Health, Monheim, Germany
BD Plastipak 1 ml syringes Becton Dickinson, Heidelberg, Germany 300015 sterile Luer-Lok™ syringes with needle
Gel Loader Tips peqlab 81-13790 MµltiFlex™ Tips
Hyaluronidase Sigma-Aldrich H3884-100mg Hyaluronidase Type IV-S from Bovine test
Oxygen Air Liquide, Düsseldorf, Germany M1001L50R2A001
Isofluoran Baxter, Unterschleißheim, Germany
pGEM-T Easy Promega, Mannheim, Germany
Oligonucleotides Eurofins MWG, Ebersberg, Germany
Qiaprep Spin Midiprep Kit Qiagen, Hilden, Germany 27104
PCR DNA purification kit Qiagen, Hilden, Germany 28106
Equipment
Living Image 4.1 software Caliper Life Sciences/PerkinElmer, Rodgau, Germany
XGI-8 Gas Anesthesia System Caliper Life Sciences/PerkinElmer, Rodgau, Germany
IVIS Spectrum Imaging System Caliper Life Sciences/PerkinElmer, Rodgau, Germany
Biophotometer Eppendorf AG, Hamburg, Germany

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Saleh, M., Abdullah, M. R., Schulz, C., Kohler, T., Pribyl, T., Jensch, I., Hammerschmidt, S. Following in Real Time the Impact of Pneumococcal Virulence Factors in an Acute Mouse Pneumonia Model Using Bioluminescent Bacteria. J. Vis. Exp. (84), e51174, doi:10.3791/51174 (2014).

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