Streptococcus pneumoniae är den ledande patogen orsakar svår samhällsförvärvad lunginflammation och ansvarig för mer än 2 miljoner dödsfall i världen. Effekterna av bakteriella faktorer inblandade i fitness eller virulens kan följas i realtid på en akut mus lunginflammation eller bakteriemi modell med självlysande bakterier.
Lunginflammation är en av de största hälso-och sjukvårdsproblem i utvecklingsländer och industrialiserade länder och är förenat med betydande morbiditet och mortalitet. Trots framsteg inom kunskap om denna sjukdom, tillgången på intensivvårdsavdelningar (IVA), och användning av potenta antimikrobiella medel och effektiva vaccin, dödligheten förblir hög 1. Streptococcus pneumoniae är den ledande patogen av samhällsförvärvad pneumoni (CAP) och en av de vanligaste orsakerna till bakteriemi hos människa. Denna patogen är utrustad med en arsenalen av yt-exponerade adhesinerna och virulensfaktorer som bidrar till lunginflammation och invasiv pneumokocksjukdom (IPS). Bedömningen av vilken roll in vivo av bakteriella fitness eller virulensfaktorer är av yttersta vikt för att riva upp S. pneumoniae patogenicitet mekanismer. Musmodeller av lunginflammation, bakteriemi och meningit används för att bedöma effekten av pneumokocker faktorer vid difka stadier av infektionen. Här beskriver vi ett protokoll för att övervaka i realtid pneumokock spridning i möss efter intranasal eller intraperitoneala infektioner med självlysande bakterier. Resultaten visar förökning och spridning av pneumokocker i de nedre luftvägarna och blod, som kan visualiseras och utvärderas med hjälp av ett bildsystem och medföljande analysprogram.
Luftvägsinfektioner orsakade av virus eller bakterier förbli en av de vanligaste samhällsförvärvad eller kliniska problem världen över orsakar ungefär en tredjedel av alla dödsfall i världen. De viktigaste bakteriearter är Haemophilus influenzae och Streptococcus pneumoniae 2. Dessa bakteriearter är normalt vanliga beståndsdelarna i den naturliga luftvägsfloran. Bakteriell vagn är alltså också av viss risk för invasiv sjukdom och beroende på immunstatus eller anlag för individerna. Den asymtomatisk kolonisering utlöses till invasiva infektioner. Streptococcus pneumoniae är den ledande patogen av samhällsförvärvad pneumoni (CAP) och en av de vanligaste orsakerna till bakteriemi hos människor. Hos friska individer S. pneumoniae (pneumokocker) är ofta asymtomatiska och ofarliga kolonisatörer i de övre luftvägarna, där de konfronteras med icke-patogena bakterierav de inhemska växter men även med patogener som Haemophilus spp.. eller Staphylococcus aureus och den första raden i det mänskliga immunförsvaret. Transport är högst i små barn (37%) och ännu högre inom trånga daghem (58%) 3-5. Den yngsta befolkningen och de äldre, tar emot pneumokocker via transmission aerosol från transportörer och nasofaryngeala sekret 6, tillhör högriskgrupper och vaccination genom att använda en av konjugerat pneumokock vaccin (PCV10 eller PCV13 hos barn och 23-valent polysackarid PPSV23 hos vuxna) rekommenderas i USA (US) och många europeiska länder 4. Den PPSV23 omfattar serotyper som är ansvariga för ~ 90% av de bacteremic pneumokocksjukdomar i USA och Europa, hindrar därmed effektivt invasiva pneumokocksjukdomar (IPD) hos vuxna, medan PCVs täcker de vanligaste serotyperna hos barn. Följaktligen IPD grund av vaccintyper (VT) är reduced men nonvaccine serotyper visar en hög virulens potential och antibiotikaresistens har uppstått 4,7-12. Nasofarynx eftersom behållaren är utgångspunkten för pneumokocker att sprida sig till bihålorna eller mellersta öron initierar skadliga lokala infektioner. Viktigare, pneumokocker sprids direkt via luftvägarna till bronker och lungor vilket leder till livshotande CAP 4,13. Lunginfektioner är ofta tillsammans med vävnad och barriär förstörelse, så att patogenen att sprida sig in i blodet och orsakar IPD. Förekomsten av den gemensamma jordbrukspolitiken och IPD är högst i nedsatt immunförsvar personer eller i extremlägena för ålders 4,13. De omständigheter som ansvarar för omvandlingen från en kommen till en patogen med hög virulens är fortfarande under diskussion. Men förutom förändringar i värd känslighet och evolutionär anpassning tillsammans med högre virulens och ökningen av antibiotika resistanser har föreslagits att ha en avgörande inverkan på pneumococcal infektioner 14-16.
Den patogen är utrustad med en mångfald av adhesiner förmedlar intim kontakt till mukosala epitelceller. Efter att övervinna luftvägarna slem, är pneumokocker vidhäftning till värdceller underlättas genom direkta interaktioner av yt-exponerade adhesinerna med cellulära receptorer och genom att utnyttja extracellulära matrixkomponenter eller serumproteiner som överbryggande molekyler 4,17,18. Som mångsidiga patogener pneumokocker är också utrustade med faktorer som kringgående av värdimmun försvarsmekanismer. Dessutom har de förmågan att anpassa sig till olika värdmiljöer såsom lunga, blod och cerebrospinalvätska (CSF), respektive 5,17,19,20.
Effekterna av bakteriella faktorer på patogenes och inflammatorisk värdsvar undersöks i experimentella djurmodeller av lunginflammation, bakteriemi, eller meningit 21-25. Trots att en mänsklig patogen, dessa modeller är vill-etablerade dechiffrera pneumokock vävnad tropism, virulens mekanismer, eller protectivity av pneumokockvaccin kandidater. Den genetiska bakgrunden av inavlade musstammar bestämmer mottagligheten för pneumokocker. BALB / c-möss intranasalt infekterade med pneumokocker befanns vara resistent, medan CBA / Ca och SJL möss var mer känslig mot pneumokockinfektioner 22. Detta innebär att, i likhet med människor, den genetiska bakgrunden och värdförsvarsmekanismerna att avgöra resultatet av infektionen. Därför krävs ytterligare ansträngningar för att riva upp motstånds loci i genomet hos möss är mindre känsliga för pneumokockinfektioner. Resultaten har lett till förändringar i in vivo virulens protokoll. I stället för de inavlade BALB / c-möss som ofta används i det förflutna, är de mycket känsliga CD-1/MF1 utavlade musstammar numera ofta för att studera effekten av förlust-av-funktion pneumokock virulens eller lämplighet faktorer 26-28. Dessutom är tillgångenav bioluminescent pneumokocker och optiska avbildningstekniker gör det möjligt för realtids bioluminescens bioimaging av infektioner. I pneumokocker den optimerade luxABCDE genkassett (plasmid Paul-A Tn 4001 luxABCDE Km ^) har satts in i ett enda ställe på kromosomen genom transposonmutagenes integration. Bioluminescent pneumokocker har använts för att utvärdera dämpningen av pneumokock-mutanter med brist på virulens eller träningsfaktorer och dess translokation från en anatomisk plats till en annan 26,28-31.
Här ger vi ett protokoll för bioimaging av pneumokockinfektioner i en mus lunginflammation eller blodförgiftning modell. Amplifiering och spridning av bioluminescent pneumokocker i intranasalt eller intraperitonealt infekterade möss kan lätt följas över tid med användning av ett optiskt avbildningssystem och samma djur vid olika tidpunkter.
Alla experiment som utförts på djur måste godkännas av lokala myndigheter och etikkommissioner. I in vivo-infektionsexperiment den bakteriella belastningen i de olika värd nischer av infekterade djur måste bestämmas vid olika tidpunkter efter infektion. Under dessa experimentella förhållanden djuren måste offras innan isolering av bakterier från blod, nasofarynx, bronchoalvelar sköljning, eller organ såsom lungor, mjälte och hjärna. För att beräkna antalet bakterier per värd nisch och be…
The authors have nothing to disclose.
Forskning i labbet har finansierats med bidrag från Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG HA 3125/3-2, DFG HA 3125/4-2) och förbundsministeriet för utbildning och forskning (BMBF) Medicinsk Infektion Genomics (FKZ 0315828A) till SH.
Todd Hewitt broth | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | X936.1 | |
Yeast extract | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 2363.2 | |
Blood agar plates | Oxoid, Wesel, Germany | PB5039A | |
Kanamycin | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | T832.2 | |
Erythromycin | Sigma-Aldrich,Taufkirchen, Germany | E6376 | |
fetal bovine serum (FBS) | PAA Laboratories, Coelbe, Germany | A11-151 | |
CD-1 mice, female | Charles River, Sulzfeld, Germany | CD1SIFE06W08W | female CD-1 mice, six to eight weeks old |
Ketamin 500mg, Curamed injection solution | Schwabe-Curamed, Karlsruhe, Germany | ||
Rompun 2%, injection solution | Bayer Animal Health, Monheim, Germany | ||
BD Plastipak 1 ml syringes | Becton Dickinson, Heidelberg, Germany | 300015 | sterile Luer-Lok™ syringes with needle |
Gel Loader Tips | peqlab | 81-13790 | MµltiFlex™ Tips |
Hyaluronidase | Sigma-Aldrich | H3884-100mg | Hyaluronidase Type IV-S from Bovine test |
Oxygen | Air Liquide, Düsseldorf, Germany | M1001L50R2A001 | |
Isofluoran | Baxter, Unterschleißheim, Germany | ||
pGEM-T Easy | Promega, Mannheim, Germany | ||
Oligonucleotides | Eurofins MWG, Ebersberg, Germany | ||
Qiaprep Spin Midiprep Kit | Qiagen, Hilden, Germany | 27104 | |
PCR DNA purification kit | Qiagen, Hilden, Germany | 28106 | |
Equipment | |||
Living Image 4.1 software | Caliper Life Sciences/PerkinElmer, Rodgau, Germany | ||
XGI-8 Gas Anesthesia System | Caliper Life Sciences/PerkinElmer, Rodgau, Germany | ||
IVIS Spectrum Imaging System | Caliper Life Sciences/PerkinElmer, Rodgau, Germany | ||
Biophotometer | Eppendorf AG, Hamburg, Germany |