评估小鼠浆细胞树突状细胞在淋巴集结的开发利用造血祖细胞的过继转移
Summary
这个协议描述的实验程序来评估浆细胞样树突细胞的Peyer氏从共同的树突状细胞前体细胞的补丁的分化，使用涉及FACS介导的细胞分离，水动力的基因转移，并在淋巴集结免疫子集流分析技术。
Abstract
该协议详细介绍了分析纯化造血祖细胞在肠道淋巴集结（PP）的产生浆细胞树突状细胞（PDC）的能力的方法。常见的树突状细胞前体细胞（个CDP，林–的c-kit 罗 CD115 +的Flt3 +）从C57BL6小鼠的骨髓中纯化，通过FACS，并转移到缺乏一个显著的pDC群中的PP受体小鼠，在这种情况下，IFNAR – / –小鼠用作转移接收者。在某些小鼠中，树突状细胞生长因子Flt3配体（FLT3L）的过度表达到代管个CDP转移之前执行，使用FLT3L编码质粒流体力学基因转移（HGT）。 FLT3L过度扩张DC群转自（或内源性的）造血祖细胞起源。在祖转让后7-10天，即产生过继转移的祖细胞的pDCs从受体细胞进行区分的CD45标志物表达，与转个CDP是CD45.1 +和受助人CD45.2 + pDCs细胞的基础。转个CDP的贡献到PDC人口PP和向FLT3L反应能力是由从受体小鼠的PP单细胞悬液流式细胞仪检测。此方法可用于测试其他祖种群是否能够产生PP的pDCs的。此外，该方法可用于检查被预测影响的pDC发育中的PP，通过将前体亚群与推定的发育因子和/或一个适当的击倒，敲除或过表达由通过HGT操纵循环细胞因子是因子的作用。此方法还可以使聚丙烯的pDCs如何影响在其他的PP免疫亚群的频率或功能分析。这种方法的特点是采用IFNAR的– / –小鼠，这表明严重枯竭PP的pDC相对于野生型动物，从而allowiPP的pDCs在没有从致命的辐射影响因子纳克重建。
Introduction
在这里，我们展示了一个协议，以评估共同树突状细胞祖细胞（个CDP）是否能够在浆细胞树突状细胞（PDC）人口淋巴集结（PP）引起。使用这种方法的总体目标是评估的pDC的淋巴集结（PP pDCs细胞）的发育调控。的原因，这是很重要的是，聚丙烯的pDCs从其他组织，包括骨髓，血液和脾脏中找到的pDCs不同的，因此，目前还不清楚PP的pDC和其他的pDC群是否发育和/或功能上相关的。具体来说，pDCs细胞被广泛称为是主要的I型干扰素（IFN）生产者造血系统中，响应Toll样受体7和9（TLR7 / 9）快速干扰素分泌1-3刺激。然而，PP的pDCs是缺乏生产型干扰素响应TLR激动剂刺激4,5。此外，聚丙烯的pDCs也从发现在骨髓和脾脏中的pDCs不同要求从类型信号I干扰素（IFN）受体（IFNAR1）或干扰素信号分子STAT1为他们的发展和/或积累5。这些数据表明，不同的监管机制，控制PP的pDCs与其他器官pDCs细胞（ 如骨髓，脾）5的可能性。
导致这一方法的发展的基本原理是基于在理解树突状细胞（DC）的生物学的最新进展。大多数，如果不是全部，DC亚群从表达该FMS-样酪氨酸激酶3受体（的Flt3）6-10造血祖细胞派生，但是，直流发展并不局限于经典的髓系和淋巴途径。例如，FLT3 +普通髓系祖细胞（中医师，林– IL-7R –的Sca-1 –的c-kit + CD34 +细胞FcγRLO / – ）来个CDP（林–的c-kit 罗 CD115 +的Flt3 +）引起，whic率进一步分化成PDC和传统的DC中心（CDC）9,10。相比之下，FLT3 +普通淋巴祖细胞（的CLP，林– IL-7R +的Sca-1 LO的c-kit LO），主要发展为pDCs细胞11。因此，以前的研究表明的pDCs产生下FLT3L的调节至少2个不同的造血祖细胞群体，虽然典型的分析已被限制在骨髓，脾脏和/或血液的pDC亚群。因此，生成聚丙烯的pDCs的祖人口（S）所需的调查。了解PP pDCs细胞的起源将揭示他们是否与其他的pDC人群有着共同的发展途径光线，或者他们这一代人在PP中使用不同的机制。
本文所述的方法的独特优点是使用，显示严重不足的PP pDCs细胞为受体的造血祖细胞的过继转移小鼠。小鼠基因抽动缺失该基因编码的IFNAR1（IFNAR – / –小鼠）或STAT1（STAT1 – / – ）揭示了PP的pDCs 5一个惊人的消耗。因此，这些菌株提供一种聚丙烯的pDCs被还原的环境，允许继转移研究，在缺少有效的细胞消融制度如致死照射来进行。这里提出的方法的另外一个优势是利用流体力学基因转移（HGT）来刺激FLT3L升高的循环量。这提供了以诱导FLT3L 体内 ，相对于注射重组蛋白的具成本效益的方法。大量的研究，包括那些在我们的实验室中，聘用HGT诱导细胞因子的量在各种实验条件5,12,13。
劳动和精确的免疫功能区议会的划分是在免疫学的主要兴趣。特别是，pDCs细胞是口服耐受和全身抗病毒的重要介质反应，但它们也似乎有助于自身免疫和癌症14-17的发展和持续性。本文所述的协议将允许调节聚丙烯的pDCs的发育机制更加充分的探讨。此外，这种方法可能会允许研究，以评估PP pDC的功能，并且可以扩展到理解中的PP其他免疫人群的调节和功能。
Protocol
Representative Results
Discussion
本文所描述的过继转移技术评估个CDP到PP的pDC群在受体小鼠中有缺陷的聚丙烯的pDCs的贡献（ 例如IFNAR – / –小鼠）。在以后的实验中，这将是重要的，以评估其他祖亚群的电位在产生的PP的pDCs，特别是聚丙烯的pDCs是否从的Flt3 +的CLPs派生。这个问题是显著，因为目前还不清楚为什么PP pDCs细胞具有独特的敏感，适用于PP累计5 IFNAR-STAT1信号，而且如果PP的pDCs遵循类似的发?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们感谢博士。亚历克斯格尔巴德和威廉Overwijk的流体力学基因转移的建议。这项工作是由美国国立卫生研究院（AI098099，西南），MD安德森癌症中心的表观遗传学，MD安德森中心的炎症和癌症（SSW），和RE鲍勃史密斯教育基金（HSL）的资金支持。
Materials
| C57BL/6J | JAX | 664 | |
| B6.SJL | JAX | 2014 | |
| RPMI | Invitrogen | 11875-093 | |
| 15 ml conical tubes | BD Biosciences | 352095 | |
| 50 ml conical tubes | BD Biosciences | 352070 | |
| Sterile surgical tweezers | |||
| Sterile small pair scissors | |||
| Sterile large pair scissors | |||
| 40 μm cell strainer | BD Biosciences | 352340 | |
| 35 μm cell strainer cap tubes | BD Biosciences | 352235 | |
| RBC lysing buffer | Sigma | R7757 | |
| FACS buffer | PBS, 2 mM EDTA, 1% FCS, filter sterilized | ||
| Percoll | GE Healthcare | 17089102 | |
| 10XHBSS | Sigma | H4641 | |
| Collagenase IV | Worthington | LS004188 | |
| Goat ant-rat IgG microbeads | Milteyni Biotec | 130-048-501 | |
| LD column | Milteyni Biotec | 130-042-901 | |
| Rat anti-D3 | BD Biosciences | 555273 | |
| Rat anti-CD19 | BD Biosciences | 553783 | |
| Rat anti-CD11b | BD Biosciences | 553308 | |
| Rat anti-CD11c | BD Biosciences | 553799 | |
| Rat anti-Ter119 | BD Biosciences | 553671 | |
| Anti-CD3 (PerCP) | eBiosciences | 45-0031 | |
| Anti-CD19 (PerCP) | eBiosciences | 45-0193 | |
| Anti-CD11b (PerCP) | eBiosciences | 45-0112 | |
| Anti-CD11c (PerCP) | eBiosciences | 45-0114 | |
| Anti-F4/80 (PerCP) | eBiosciences | 45-4801 | |
| Anti-Ter119 (PerCP) | eBiosciences | 45-5921 | |
| Anti-Sca-1 (PE.Cy7) | eBiosciences | 25-5981 | |
| Anti-CD115 (APC) | eBiosciences | 17-1152 | |
| Anti-c-kit (APC.Cy7) | eBiosciences | 47-1171 | |
| Anti-IL-7R (Pacific Blue) | eBiosciences | 48-1271 | |
| Anti-Flt3 (PE) | eBiosciences | 12-1351 | |
| Anti-CD45.1 (APC.Cy7) | BD Biosciences | 560579 | |
| Anti-CD45.2 (PE.Cy7) | Biolegend | 109830 | |
| Anti-CD11c (Pacific Blue) | eBiosciences | 48-0114 | |
| Anti-B220 (APC) | eBiosciences | 25-0452 | |
| Anti-Siglec-H (PE) | eBiosciences | 12-0333 | |
| Anti-PDCA-1 (FITC) | eBiosciences | Nov-72 | |
| Cell sorter | BD Biosciences | e.g. BD Fortessa | |
| Heat lamp | |||
| Mouse restrainer | |||
| 1 ml syringes | Becton Dickinson | 309602 | |
| 27½ G needles (sterile) | Becton Dickinson | 305109 |
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