Vurdere utvikling av Murint Plasmacytoid dendrittiske celler i Peyer sin Patches Bruke Adoptive Overføring av Hematopoietic stamfedre
Summary
Denne protokollen beskriver eksperimentelle prosedyrer for å vurdere differensiering av plasmacytoid dendrittiske celler i Peyer patch fra vanlige dendrittiske cellen stamfedre, ved hjelp av teknikker som involverer FACS-mediert celle isolasjon, hydrodynamisk genoverføring, og strømningsanalyse av immun undergrupper i Peyer patch.
Abstract
Denne protokollen detaljer en fremgangsmåte til å analysere evnen til renset hematopoetiske stamceller for å generere dendrittiske celler plasmacytoid (PDC) i tarmen Peyer patch (PP). Vanlige dendrittiske cellen stamfedre (CDPs, lin – c-kit lo CD115 + Flt3 +) ble renset fra benmargen av C57BL6 mus ved FACS og overført til mottaker mus som mangler en betydelig PDC befolkningen i PP, i dette tilfellet, IFNAR – / – mus ble benyttet som overføringsmottakere. I noen mus, ble overekspresjon av den dendrittiske cellen vekstfaktor Flt3 ligand (Flt3L) håndheves før adoptiv overføring av CDPs, ved hjelp av hydrodynamisk genoverføring (HGT) av Flt3L-koding plasmid. Flt3L overekspresjon utvider DC populasjoner som stammer fra overført (eller endogene) blodkreft stamceller. På 7-10 dager etter stamfar overføring, ble PDCs som oppstår fra de adoptively overført progenitors skilles fra mottakercellene pågrunnlag av CD45 markør uttrykk, med PDCs fra overførte CDPs være CD45.1 + og mottakere blir CD45.2 +. Muligheten av overførte CDPs å bidra til PDC-populasjonen i PP og til å reagere på Flt3L ble evaluert ved strømningscytometri for PP enkeltcellesuspensjoner fra mottaker mus. Denne metoden kan benyttes til å teste om andre progenitor populasjoner er i stand til å generere PP PDCs. I tillegg kan denne tilnærming brukes til å undersøke rollen til faktorer som er anslått til å påvirke utvikling PdC i PP, ved å overføre progenitor delmengder med en passende knockdown, utstansing eller overekspresjon av de putative utviklingsfaktor og / eller ved å manipulere sirkulerende cytokiner via HGT . Denne metoden kan også tillate analyse av hvordan PP PDCs påvirke frekvensen eller funksjon av andre immun undergrupper i PP. Et unikt trekk ved denne metode er bruken av IFNAR – / – mus, som viser sterkt utarmet PP PDCs i forhold til vill-type dyr, og dermed allowing tilberedning av PP PDCs i fravær av konfunderende effekter av dødelig bestråling.
Introduction
Her viser vi en protokoll for å vurdere om felles dendrittiske cellen stamfedre (CDPs) er i stand til å gi opphav til plasmacytoid dendrittiske cellen (PDC) befolkningen i Peyer patch (PP). Det overordnede målet med denne metoden var å evaluere utviklings regulering av PDCs i Peyer patch (PP PDCs). Grunnen til at dette er viktig er at PP PDCs avvike fra PDCs funnet i andre vev, inkludert beinmarg, blod og milt, og derfor er det uklart om PP PDCs og andre PDC bestandene er utviklingshemmede og / eller funksjonelt beslektet. Spesielt er PDCs viden kjent for å være den viktigste type I interferon (IFN) produsenter innen blodkreft systemet, svarer til Toll-like receptor 7 og 9 (TLR7 / 9) stimulering av rask IFN sekresjon 1-3. Imidlertid PP PDCs er mangelfull produksjon av type I IFN som reaksjon på TLR agonist stimulering 4,5. Videre PP PDCs også avvike fra PDCs funnet i benmarg og milt ikrever signaler fra type I interferon (IFN)-reseptor (IFNAR1) eller IFN signale molekyl STAT1 for deres utvikling og / eller akkumulering 5. Disse data har antydet muligheten for at forskjellige reguleringsmekanismer styre PP PDCs versus PDCs i andre organer (f.eks benmarg, milt) 5.
Begrunnelsen som førte til utviklingen av denne metoden var basert på nyere fremskritt i forståelsen av dendrittiske celler (DC) biologi. De fleste, om ikke alle, DC undergrupper stammer fra hematopoetiske stamceller som uttrykker den fms-lignende tyrosin-kinase-3-reseptor (Flt3) 6-10, men er like utvikling ikke er begrenset til de klassiske myeloid-og lymfoide trasé. For eksempel, FLT3 + felles myeloide stamceller (CMPS, lin – IL-7R – Sca-1 – c-kit + CD34 + FcγR lo / -) gi opphav til CDPs (lin – c-kit lo CD115 + Flt3 +), hh ytterligere differensiere i PDCs og konvensjonelle DCs (CDCS) 9,10. I motsetning Flt3 + felles lymfoide stamceller (CLPs, LIN – IL-7R + Sca-en lo c-kit lo) utvikler primært inn PDCs 11. Derfor er tidligere studier indikerer PDCs oppstår fra minst 2 forskjellige hematopoietiske progenitor populasjoner under regulering av Flt3L, selv om den typisk analyse har vært begrenset til benmarg, milt-og / eller blod PDC undergrupper. Dermed kreves stamfar befolkningen (e) som genererer PP PDCs etterforskning. Forstå opprinnelsen til PP PDCs vil belyse om de har felles utviklingsforløp med andre PDC populasjoner, eller benytte forskjellige mekanismer i løpet av sin generasjon i PP.
En unik fordel med den metode som her er beskrevet er anvendelse av mus som viser en alvorlig mangel i PP PDCs som mottakere for adoptiv overføring av hematopoetiske stamceller. Mus med genettic sletting i genet som koder IFNAR1 (IFNAR – / – mus) eller STAT1 (STAT1 – / -) avslørte en slående uttømming i PP PDCs fem. Derfor er disse stammer gi et miljø hvori PP PDCs er redusert, slik at adoptive overførings undersøkelser som skal utføres i fravær av potente celle ablasjon regimer som letal bestråling. En ytterligere styrke av fremgangsmåten presentert her er bruken av hydrodynamisk genoverføring (HGT) for å stimulere forhøyede sirkulerende mengder av Flt3L. Dette gir en kostnadseffektiv metode for å indusere Flt3L in vivo, sammenlignet med injeksjon av rekombinant protein. Tallrike studier, inkludert de i vår lab, har ansatt HGT å indusere cytokin mengder i en rekke eksperimentelle forhold 5,12,13.
Arbeidsdelingen og presise immunfunksjoner for DCs er av stor interesse for immunologi. Spesielt PDCs er viktige mediatorer av oral toleranse og systemisk anti-viralsvar, men de synes også å bidra til utvikling og utholdenhet av autoimmunitet og kreft 14-17. Den protokoll som er beskrevet heri vil tillate den utviklingsmessige mekanismene som regulerer PP PDCs vil bli mer fullstendig utforsket. I tillegg kan denne tilnærming tillater undersøkelser for å vurdere PP PDC-funksjonen, og kan forlenges til å forstå regulering og funksjon av andre immun populasjoner i PP.
Protocol
Representative Results
Discussion
Adoptivoverføringsteknikk beskrevet her vurderes bidraget av CDPs til PP PDC befolkningen i mottaker mus som er mangelfull i PP PDCs (f.eks IFNAR – / – mus). I senere eksperimenter, vil det være viktig å vurdere potensialet i andre progenitor undergrupper i generere PP PDCs, særlig hvorvidt PP PDCs utlede fra FLT3 + CLPs. Dette spørsmålet er viktig siden det er fortsatt uklart hvorfor PP PDCs er unikt følsomme for IFNAR-STAT1 signaler for PP opptjening 5, og hvis PP PDCs …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker legene. Alex Gelbard og Willem Overwijk for råd om hydrodynamisk genoverføring. Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra NIH (AI098099, SSW), MD Anderson Center for Cancer epigenetikk, MD Anderson Center for Betennelse og kreft (SSV), og RE Bob Smith Education Fund (HSL).
Materials
| C57BL/6J | JAX | 664 | |
| B6.SJL | JAX | 2014 | |
| RPMI | Invitrogen | 11875-093 | |
| 15 ml conical tubes | BD Biosciences | 352095 | |
| 50 ml conical tubes | BD Biosciences | 352070 | |
| Sterile surgical tweezers | |||
| Sterile small pair scissors | |||
| Sterile large pair scissors | |||
| 40 μm cell strainer | BD Biosciences | 352340 | |
| 35 μm cell strainer cap tubes | BD Biosciences | 352235 | |
| RBC lysing buffer | Sigma | R7757 | |
| FACS buffer | PBS, 2 mM EDTA, 1% FCS, filter sterilized | ||
| Percoll | GE Healthcare | 17089102 | |
| 10XHBSS | Sigma | H4641 | |
| Collagenase IV | Worthington | LS004188 | |
| Goat ant-rat IgG microbeads | Milteyni Biotec | 130-048-501 | |
| LD column | Milteyni Biotec | 130-042-901 | |
| Rat anti-D3 | BD Biosciences | 555273 | |
| Rat anti-CD19 | BD Biosciences | 553783 | |
| Rat anti-CD11b | BD Biosciences | 553308 | |
| Rat anti-CD11c | BD Biosciences | 553799 | |
| Rat anti-Ter119 | BD Biosciences | 553671 | |
| Anti-CD3 (PerCP) | eBiosciences | 45-0031 | |
| Anti-CD19 (PerCP) | eBiosciences | 45-0193 | |
| Anti-CD11b (PerCP) | eBiosciences | 45-0112 | |
| Anti-CD11c (PerCP) | eBiosciences | 45-0114 | |
| Anti-F4/80 (PerCP) | eBiosciences | 45-4801 | |
| Anti-Ter119 (PerCP) | eBiosciences | 45-5921 | |
| Anti-Sca-1 (PE.Cy7) | eBiosciences | 25-5981 | |
| Anti-CD115 (APC) | eBiosciences | 17-1152 | |
| Anti-c-kit (APC.Cy7) | eBiosciences | 47-1171 | |
| Anti-IL-7R (Pacific Blue) | eBiosciences | 48-1271 | |
| Anti-Flt3 (PE) | eBiosciences | 12-1351 | |
| Anti-CD45.1 (APC.Cy7) | BD Biosciences | 560579 | |
| Anti-CD45.2 (PE.Cy7) | Biolegend | 109830 | |
| Anti-CD11c (Pacific Blue) | eBiosciences | 48-0114 | |
| Anti-B220 (APC) | eBiosciences | 25-0452 | |
| Anti-Siglec-H (PE) | eBiosciences | 12-0333 | |
| Anti-PDCA-1 (FITC) | eBiosciences | Nov-72 | |
| Cell sorter | BD Biosciences | e.g. BD Fortessa | |
| Heat lamp | |||
| Mouse restrainer | |||
| 1 ml syringes | Becton Dickinson | 309602 | |
| 27½ G needles (sterile) | Becton Dickinson | 305109 |
References
- Cella, M., et al. Plasmacytoid monocytes migrate to inflamed lymph nodes and produce large amounts of type I interferon. Nat. Med. 5 (8), 919-923 .
- Siegal, F. P., et al. The nature of the principal type 1 interferon-producing cells in human blood. Science. 284 (5421), 1835-1837 .
- Asselin-Paturel, C., et al. Mouse type I IFN-producing cells are immature APCs with plasmacytoid morphology. Nat. Immunol. 2 (12), 1144-1150 .
- Contractor, N., Louten, J., Kim, L., Biron, C. A., Kelsall, B. L. Cutting edge: Peyer’s patch plasmacytoid dendritic cells (pDCs) produce low levels of type I interferons: possible role for IL-10, TGFbeta, and prostaglandin E2 in conditioning a unique mucosal pDC phenotype. J. Immunol. 179 (5), 2690-2694 (2007).
- Li, H. S., et al. Cell-intrinsic role for IFN-alpha-STAT1 signals in regulating murine Peyer patch plasmacytoid dendritic cells and conditioning an inflammatory response. Blood. 118 (14), 3879-3889 (2011).
- D’Amico, A., Wu, L. The early progenitors of mouse dendritic cells and plasmacytoid predendritic cells are within the bone marrow hemopoietic precursors expressing Flt3. J. Exp. Med. 198 (2), 293-303 .
- Fogg, D. K., et al. A clonogenic bone marrow progenitor specific for macrophages and dendritic cells. Science. 311 (5757), 83-87 .
- Liu, K., et al. In vivo analysis of dendritic cell development and homeostasis. Science. 324 (5925), 392-397 (2009).
- Naik, S. H., et al. Development of plasmacytoid and conventional dendritic cell subtypes from single precursor cells derived in vitro and in vivo. 8 (11), 1217-1226 .
- Onai, N., et al. Identification of clonogenic common Flt3+M-CSFR+ plasmacytoid and conventional dendritic cell progenitors in mouse bone marrow. Nat. Immunol. 8 (11), 1207-1216 (2007).
- Sathe, P., Vremec, D., Wu, L., Corcoran, L., Shortman, K. Convergent differentiation: myeloid and lymphoid pathways to murine plasmacytoid dendritic cells. Blood. 121 (1), 11-19 .
- Hirai, H., et al. C/EBPbeta is required for ’emergency’ granulopoiesis. Nat. Immunol. 7 (7), 732-739 (2006).
- Overwijk, W. W., et al. Immunological and antitumor effects of IL-23 as a cancer vaccine adjuvant. J. Immunol. 176 (9), 5213-5222 (2006).
- Cervantes-Barragan, L., et al. Plasmacytoid dendritic cells control T-cell response to chronic viral infection. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109 (8), 3012-3017 (2012).
- Goubier, A., et al. Plasmacytoid dendritic cells mediate oral tolerance. Immunity. 29 (3), 464-475 (2008).
- Lande, R., et al. Neutrophils activate plasmacytoid dendritic cells by releasing self-DNA-peptide complexes in systemic lupus erythematosus. Sci. Transl. Med. 3 (73), .
- Liu, C., et al. Plasmacytoid dendritic cells induce NK cell-dependent, tumor antigen-specific T cell cross-priming and tumor regression in mice. J. Clin. Invest. 118 (3), 1165-1175 (2008).
- Fagarasan, S., Honjo, T. Intestinal IgA synthesis: regulation of front-line body defences. Nat. Rev. Immunol. 3 (1), 63-72 (2003).
- Cisse, B., et al. Transcription factor E2-2 is an essential and specific regulator of plasmacytoid dendritic cell development. Cell. 135 (1), 37-48 (2008).
- Blasius, A. L., et al. Bone marrow stromal cell antigen 2 is a specific marker of type I IFN-producing cells in the naive mouse, but a promiscuous cell surface antigen following IFN stimulation. J. Immunol. 177 (5), 3260-3265 (2006).
- Symons, A., Budelsky, A. L., Towne, J. E. Are Th17 cells in the gut pathogenic or protective. Mucosal. Immunol. 5 (1), 4-6 (2012).
