Растяжка Micropatterned клеток на PDMS мембраны
Summary
Эта рукопись представляет технику применять или освободить силы на прикрепленных клеток или тканей с использованием однонаправленной растяжения.
Abstract
Механические силы, действующие на клетки и / или ткани играют важную роль в многочисленных процессов. Мы разработали устройство, чтобы растянуть клетки высевают на полидиметилсилоксан (PDMS) мембраны, совместимый с изображениями. Эта техника является воспроизводимым и универсальным. PDMS мембрана может быть micropatterned для того, чтобы ограничить клеток или тканей с определенным геометрии. Первым шагом является печать micropatterns на мембране PDMS с глубоким техники УФ. PDMS мембраны затем монтируется на механическом носилках. Камера связан в верхней части мембраны с биосовместимым смазки, чтобы позволить скольжения во время растяжения. Клетки высевают и давали возможность распространяться в течение нескольких часов на micropatterns. Образец может быть растянут и растяжений несколько раз с использованием микрометрического винта. Это займет меньше минуты, чтобы применить на участке в полном объеме (около 30%). Техника, представленная здесь не включает моторизованный устройство, которое необходимо дляpplying повторяющихся циклов растяжения быстро и / или управляется компьютером растяжения, но это может быть осуществлено. Растяжение клеток или тканей может представлять интерес для вопросов, связанных с сотовых сил, клеточного ответа к механическим воздействиям или ткани формообразования. Это видео презентация покажет, как избежать типичных проблем, которые могут возникнуть при выполнении этого типа, казалось бы, простого эксперимента.
Introduction
Клетки, составляющие ткань у высших организмов подвержены механическим напряженности и растягивающих сил ближайшие либо из внешней среды или от окружающих клеток 1,2. Клетки должны адаптироваться и противостоять эти силы для поддержания целостности тканей. Такие силы также важны для тканей формообразования во время разработки 3,4. Применение механических сил на культивируемых клетках это способ имитировать то, что может произойти в ткани, но с количественным и независимого управления формы клеток и деформации клеток 5,6. Для этого несколько методов могут быть использованы. Можно нажать на клетках (вся клетка или ее часть), например с помощью АСМ или производные 7,8 или растянуть подложки клетки, растущие на.
Метод, описанный в этой статье показано, как растянуть плоскости подложки, покрытая клетками. Этот метод был первоначально разработан для оценки роли сил, действующих на мitotic клетки млекопитающих 9. Митотических клеток оставаться на связи с подложкой через отвода волокон и растяжения мембрану, оказываемое усилие на тех волокон, которые, в свою очередь, спровоцированных вращение митотического веретена. Интерес объединения клейкие micropatterns и растяжения является достижение независимый контроль сил и формы отдельных клеток. Это, например, можно протянуть овально клетки в совершенно изотропной круглой формы, в то время как одноосное растяжение применены. Если клетки не свили на micropatterns, одноосное растяжение результаты в удлинения клеток, при этом большинство клеток, имеющих длинную ось совмещена с осью растяжения. Это то трудно отделить эффект длинной оси выравнивания и эффекта на участке, приложенного к клеткам.
Устройство подходит для любого живого изображения клеток, в том числе давно промежуток флуоресцентной микроскопии, и наркотики могут быть добавлены в течение эксперимента. Глубокий метод UVs micropatterning 10был подробно описан в Azioune соавт. был описан 11 Patterning на PDMS в Azioune др. 12. Настоящий растяжения протокол является видео версия Карпи и др. 13.
Protocol
Representative Results
Discussion
Хотя этот метод был использован много раз и проходит тщательную проверку, есть несколько важных шагов, которые могут привести к неудачного эксперимента.
О PDMS:
За эту работу, GelPak, имеющийся в продаже тонкий PDMS лист, был использован. В качестве альтернативы PDMS…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была основана Института Кюри, Париж, Франция. Механический носилки предназначены Дэмиена Cuvelier (Институт Кюри) и производится компанией Грэм (MECANIQUE-grem.com). Структурирование на PDMS был разработан Аммар Azioune (II Университета Бордо).
Materials
| GelPak | GelPak | PF-60-X4 | Different thickness/stickiness are available. One alternative could be to cast your PDMS yourself. |
| Silicon grease | GE Bayer Silicones | Baysilone-Paste | This one is biocompatible |
| Stretching device | GREM mécanique | Stretcher 2011 | |
| EDC (N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride) | Sigma | 3450 | Stable 6 months at -20 °C |
| NHS (N-Hydroxysulfosuccinimide sodium salt) | Sigma | 56485 | Protect from humidity |
| Pll-g-peg (PLL(20)-g[3.5]-PEG(2) 20 mg) | SurfaceSolutions (Zurich) | ||
| Synthetic Quartz photomask | Toppan | Take standard binary photomask in Quartz | |
| Fibronectin from bovine plasma | Sigma | F1141 |
References
- Vogel, V., Sheetz, M. Local force and geometry sensing regulate cell functions. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 7, 265-275 (2006).
- Terenna, C. R., et al. Physical mechanisms redirecting cell polarity and cell shape in fission yeast. Curr. Biol. 18 (22), 1748-1753 (2008).
- Guillot, C., Lecuit, T. Mechanics of epithelial tissue homeostasis and morphogenesis. Science. 340 (6137), 1185-1189 (2013).
- Bosveld, F., et al. Mechanical control of morphogenesis by Fat/Dachsous/Four-jointed planar cell polarity pathway. Science. 336 (6082), 724-727 (2012).
- Farhadifar, R., Roper, J. C., Aigouy, B., Eaton, S., Julicher, F. The influence of cell mechanics, cell-cell interactions, and proliferation on epithelial packing. Curr. Biol. 17, 2095-2104 (2007).
- Rauzi, M., Verant, P., Lecuit, T., Lenne, P. F. Nature and anisotropy of cortical forces orienting Drosophila tissue morphogenesis. Nat. Cell Biol. 10, 1401-1410 (2008).
- Mitrossilis, D., et al. Real-time single-cell response to stiffness. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107 (38), 16518-16523 (2010).
- Irimia, D., Charras, G., Agrawal, N., Mitchison, T., Toner, M. Polar stimulation and constrained cell migration in microfluidic channels. Lab Chip. 12, 1783-1790 (2007).
- Fink, J., et al. External forces control mitotic spindle positioning. Nat. Cell. Biol. 13 (7), 771-778 (2011).
- Azioune, A., Storch, M., Bornens, M., Théry, M., Piel, M. Simple and rapid process for single cell micro-patterning. Lab Chip. 9 (11), 1640-1642 (2009).
- Azioune, A., Carpi, N., Tseng, Q., Théry, M., Piel, M. Protein micropatterns: A direct printing protocol using deep Uvs. Methods Cell Biol. 97, 133-146 (2010).
- Azioune, A., et al. Robust method for high-throughput surface patterning of deformable substrates. Langmuir. 27 (12), 7349-7352 (2011).
- Carpi, N., Piel, M., Azioun, A., Cuvelier, D., Fink, J. Micropatterning on silicon elastomer (PDMS) with deep UVs. Protoc. Exch. , (2011).
- Sinha, B., et al. Cells respond to mechanical stress by rapid disassembly of caveolae. Cell. 144 (3), 402-413 (2011).
