PDMS Zarında Micropatterned Hücreler germe
Summary
Bu el yazması tek yönlü germe kullanarak yapışık hücreler ve dokular üzerindeki kuvvetleri uygulamak ya da serbest bırakmak için bir teknik sunuyor.
Abstract
Mekanik kuvvetler hücreleri üzerinde uygulanan ve / veya dokular, çok sayıda süreçlerinde önemli bir rol oynamaktadır. Bir polidimetilsiloksan görüntüleme ile uyumlu (PDMS) membran üzerine kaplanmıştır hücreleri uzatmak için bir cihaz geliştirdiler. Bu teknik, tekrarlanabilir ve çok yönlüdür. PDMS zar, belirli bir geometri için hücreler veya dokular sınırlandırmak amacıyla micropatterned edilebilir. İlk adım, bir derin UV tekniği ile PDMS membran üzerine micropatterns yazdırmaktır. PDMS zar daha sonra mekanik bir sedye üzerinde monte edilir. A odası boyunca uzanan kayma sağlamak için biyo-uyumlu yağı ile membran üzerine bağlıdır. Hücreler ekildi ve micropatterns birkaç saat boyunca yayılmasına izin verilir. Numune mikrometrik bir vida kullanımı ile birden çok kez gerilmiş gerek gerilmemiş edilebilir. Bu (% 30 civarında) tam ölçüde streç uygulamak için bir dakikadan az sürer. Burada sunulan tekniği için gerekli olan bir motorlu aygıt içermezhızlı bir şekilde ve / veya bilgisayar kontrollü gerilme tekrarlanan germe döngüsünden pplying, ancak bu uygulanabilir. Hücrelerin germe veya doku hücre kuvvetler, mekanik stres veya doku morfolojilerinden hücre yanıtı ile ilgili sorularınız için ilgi olabilir. Bu video sunumu görünüşte basit deney bu tür yaparken ortaya çıkabilecek tipik sorunları önlemek için nasıl gösterecektir.
Introduction
Yüksek organizmalarda bir doku oluşturan hücreler mekanik gerilimler ve dış ortamdan ya da çevreleyen hücrelerden 1,2 dan ya geliyor germe güçlerine tabidir. Hücreler uyum ve doku bütünlüğünü korumak için bu güçlere direnmek gerekir. Bu tür güçler de kalkınma 3,4 sırasında dokular morfogenezisi önemlidir. Kültürlü hücreler üzerinde mekanik kuvvet uygulayarak bir doku içinde neler olabileceğini taklit etmek bir yoldur, ancak hücre şekli ve hücre deformasyon 5,6 nicel ve bağımsız kontrolü ile. Bunun için, çeşitli teknikler kullanılabilir. Bir (bütün hücre veya bunun bir parçası), örneğin, AFM veya 7,8 türevleri ya da hücrelerin büyüdüğü alt tabakanın esneme kullanılarak hücreler üzerinde basın olabilir.
Bu yazıda anlatılan yöntem hücreleri ile kaplı bir uçak substratı germek için nasıl gösterir. Bu teknik, ilk olarak değerlendirmek için geliştirilmiştir kuvvetlerinin rolü m üzerine uygulananitotic memeli hücreleri 9. Mitotik hücreler geri çekme elyafların yoluyla alt-tabakaya bağlı kalmak ve membran germe da mitotik iğin dönmesini tahrik lifleri üzerine bir kuvvet uygulamıştır. Yapışkan birleştirme micropatterns ve germe kuvvetleri ilgi ve tek tek hücreler şeklinde bağımsız kontrol elde etmektir. Bu, tek eksenli germe uygulanır ise, mükemmel bir şekilde izotropik yuvarlak şekil, bir oval hücre uzatmak için, örneğin mümkündür. Hücreler micropatterns platted değilseniz, tek eksenli en hücreler germe ekseni ile hizalanan uzun bir eksene sahip olan, hücre uzaması sonucu germe. Bu, uzun eksen hizalama ve hücrelere uygulanan gerilme etkisinin etkisini ayırmak için daha sonra zordur.
Cihaz, uzun zaman atlamalı floresan mikroskobu da dahil olmak üzere herhangi bir canlı hücre görüntüleme için uygun olan, ve uyuşturucu deney sırasında ilave edilebilir. Derin UV'lerin micropatterning yöntemi 10Azioune ayrıntılı olarak tarif edilmiştir ve ark. PDMS 11 Desen nitelendirildi Azioune et al. 12 de protokol uzanan Mevcut Carpi et al. 13 içeren bir video versiyonu
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu teknik çok kez kullanılan ve iyice test olmasına rağmen, başarısız bir deney yol açabilir çeşitli kritik adımlar vardır.
PDMS Hakkında:
Bu iş için, GelPak, piyasada mevcut ince PDMS levha kullanılmıştır. Alternatif PDMS yaprak PDMS karışımı doğrudan döküm alınabilir. Daha tekrarlanabilir ve özel yapılmış PDMS'nin kıyasla kırmak için daha az olasıdır, çünkü GelPak kullanmanızı öneririz.
Cihaz …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma Fransa Institut Curie, Paris, tarafından kurulmuştur. Mekanik sedye Damien Cuvelier (Institut Curie) tarafından tasarlanan ve Grem tarafından üretilen (mecanique-grem.com). PDMS desenleme Ammar Azioune (Bordeaux II Üniversitesi) tarafından geliştirilmiştir.
Materials
| GelPak | GelPak | PF-60-X4 | Different thickness/stickiness are available. One alternative could be to cast your PDMS yourself. |
| Silicon grease | GE Bayer Silicones | Baysilone-Paste | This one is biocompatible |
| Stretching device | GREM mécanique | Stretcher 2011 | |
| EDC (N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride) | Sigma | 3450 | Stable 6 months at -20 °C |
| NHS (N-Hydroxysulfosuccinimide sodium salt) | Sigma | 56485 | Protect from humidity |
| Pll-g-peg (PLL(20)-g[3.5]-PEG(2) 20 mg) | SurfaceSolutions (Zurich) | ||
| Synthetic Quartz photomask | Toppan | Take standard binary photomask in Quartz | |
| Fibronectin from bovine plasma | Sigma | F1141 |
References
- Vogel, V., Sheetz, M. Local force and geometry sensing regulate cell functions. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 7, 265-275 (2006).
- Terenna, C. R., et al. Physical mechanisms redirecting cell polarity and cell shape in fission yeast. Curr. Biol. 18 (22), 1748-1753 (2008).
- Guillot, C., Lecuit, T. Mechanics of epithelial tissue homeostasis and morphogenesis. Science. 340 (6137), 1185-1189 (2013).
- Bosveld, F., et al. Mechanical control of morphogenesis by Fat/Dachsous/Four-jointed planar cell polarity pathway. Science. 336 (6082), 724-727 (2012).
- Farhadifar, R., Roper, J. C., Aigouy, B., Eaton, S., Julicher, F. The influence of cell mechanics, cell-cell interactions, and proliferation on epithelial packing. Curr. Biol. 17, 2095-2104 (2007).
- Rauzi, M., Verant, P., Lecuit, T., Lenne, P. F. Nature and anisotropy of cortical forces orienting Drosophila tissue morphogenesis. Nat. Cell Biol. 10, 1401-1410 (2008).
- Mitrossilis, D., et al. Real-time single-cell response to stiffness. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107 (38), 16518-16523 (2010).
- Irimia, D., Charras, G., Agrawal, N., Mitchison, T., Toner, M. Polar stimulation and constrained cell migration in microfluidic channels. Lab Chip. 12, 1783-1790 (2007).
- Fink, J., et al. External forces control mitotic spindle positioning. Nat. Cell. Biol. 13 (7), 771-778 (2011).
- Azioune, A., Storch, M., Bornens, M., Théry, M., Piel, M. Simple and rapid process for single cell micro-patterning. Lab Chip. 9 (11), 1640-1642 (2009).
- Azioune, A., Carpi, N., Tseng, Q., Théry, M., Piel, M. Protein micropatterns: A direct printing protocol using deep Uvs. Methods Cell Biol. 97, 133-146 (2010).
- Azioune, A., et al. Robust method for high-throughput surface patterning of deformable substrates. Langmuir. 27 (12), 7349-7352 (2011).
- Carpi, N., Piel, M., Azioun, A., Cuvelier, D., Fink, J. Micropatterning on silicon elastomer (PDMS) with deep UVs. Protoc. Exch. , (2011).
- Sinha, B., et al. Cells respond to mechanical stress by rapid disassembly of caveolae. Cell. 144 (3), 402-413 (2011).
