Stretching Micropatterned Celler på en PDMS membran
Summary
Detta manuskript presenterar en teknik för att tillämpa eller frigöra krafter på vidhäftande celler eller vävnader med hjälp av enkelriktad stretching.
Abstract
Mekaniska krafter som utövas på celler och / eller vävnader spelar en viktig roll i ett flertal processer. Vi har utvecklat en anordning för att sträcka celler utstrukna på en polydimetylsiloxan (PDMS)-membran, kompatibel med avbildning. Denna teknik är reproducerbar och mångsidig. PDMS membranet kan micropatterned för att innesluta cellerna eller vävnaderna till en specifik geometri. Det första steget är att skriva ut micropatterns på PDMS membran med en djup UV-teknik. PDMS-membran monteras därefter på en mekanisk bår. En kammare är bundet ovanpå membranet med biokompatibelt fett för att tillåta glidning under sträckningen. Cellerna ympades och tilläts sprida sig i flera timmar på micropatterns. Provet kan sträckas och osträckta flera gånger med användning av en mikrometerskruv. Det tar mindre än en minut att applicera sträckan i full utsträckning (cirka 30%). Tekniken presenteras här inte inkluderar en motordriven enhet, som är nödvändigt för enpplying upprepade stretch cykler snabbt och / eller datorstyrda stretching, men detta kan genomföras. Sträckning av celler eller vävnader kan vara av intresse för frågor som rör cellkrafter, cell svar på mekanisk belastning eller vävnadsmorfogenes. Denna video presentation kommer att visa hur man undviker vanliga problem som kan uppstå när man gör den här typen av till synes enkla experiment.
Introduction
Cellerna komponera en vävnad i högre organismer är föremål för mekaniska spänningar och stretching krafter som kommer antingen från den yttre miljön eller från omgivande celler 1,2. Cellerna måste anpassa sig till och stå emot dessa krafter för att bibehålla vävnadsintegritet. Sådana krafter är också viktiga för vävnader morfogenes under utveckling 3,4. Tillämpa mekaniska krafter på odlade celler är ett sätt att efterlikna vad som kan hända i en vävnad, men med en kvantitativ och oberoende kontroll av cellform och cell deformation 5,6. För detta ändamål kan flera metoder användas. Man kan trycka på cellerna (hela cellen eller delar av den), till exempel med hjälp av AFM eller derivat 7,8 eller sträcka underlaget cellerna växer på.
Den metod som beskrivs i detta dokument visar hur man kan tänja en plan substrat pläterad med celler. Denna teknik utvecklades ursprungligen för att bedöma betydelsen av krafter som utövas på mitotic däggdjursceller 9. Mitotiska celler hålla kontakten med substratet genom indragnings fibrer och sträckning av membranet utövas en kraft på de fibrer, vilka i sin tur framkallade vridningen av den mitotiska spolen. Intresset för att kombinera självhäftande micropatterns och stretching är att uppnå oberoende kontroll av krafter och formen på enskilda celler. Det är till exempel möjligt att sträcka en äggformad cell till en perfekt isotropa rund form, medan enaxlig sträckning appliceras. Om cellerna inte är platted på micropatterns, uniaxiell sträckning resulterar i cellförlängning, med de flesta celler har en längdaxel i linje med den sträckaxeln. Det är då svårt att särskilja effekten av den långa axeln anpassningen och effekten av sträckning appliceras till cellerna.
Enheten är lämplig för alla levande cell imaging, inklusive lång tid förflutit fluorescensmikroskopi, och droger kan läggas under experimentet. Den djupa UVs micropatterning metod 10beskrevs i detalj i Azioune et al. var 11 Mönstring på PDMS beskrev Den nuvarande stretching protokollet i Azioune et al. 12 är en videoversion av Carpi et al. 13
Protocol
Representative Results
Discussion
Även om denna teknik har använts flera gånger och är noggrant testad, det finns flera viktiga steg som kan leda till ett misslyckat experiment.
Om PDMS:
För detta arbete GelPak, en kommersiellt tillgänglig tunn PDMS ark, användes. Alternativt PDMS ark kan gjutas direkt från PDMS mix. Vi rekommenderar att du använder GelPak eftersom det är mer reproducerbar, och är mindre benägna att bryta jämfört med skräddarsydda PDMS.
Om en…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete grundades av Institut Curie, Paris, Frankrike. Den mekaniska bår designades Damien Cuvelier (Institut Curie) och tillverkas av Grem (mecanique-grem.com). Den mönstring på PDMS utvecklades av Ammar Azioune (Bordeaux II-universitetet).
Materials
| GelPak | GelPak | PF-60-X4 | Different thickness/stickiness are available. One alternative could be to cast your PDMS yourself. |
| Silicon grease | GE Bayer Silicones | Baysilone-Paste | This one is biocompatible |
| Stretching device | GREM mécanique | Stretcher 2011 | |
| EDC (N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride) | Sigma | 3450 | Stable 6 months at -20 °C |
| NHS (N-Hydroxysulfosuccinimide sodium salt) | Sigma | 56485 | Protect from humidity |
| Pll-g-peg (PLL(20)-g[3.5]-PEG(2) 20 mg) | SurfaceSolutions (Zurich) | ||
| Synthetic Quartz photomask | Toppan | Take standard binary photomask in Quartz | |
| Fibronectin from bovine plasma | Sigma | F1141 |
References
- Vogel, V., Sheetz, M. Local force and geometry sensing regulate cell functions. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 7, 265-275 (2006).
- Terenna, C. R., et al. Physical mechanisms redirecting cell polarity and cell shape in fission yeast. Curr. Biol. 18 (22), 1748-1753 (2008).
- Guillot, C., Lecuit, T. Mechanics of epithelial tissue homeostasis and morphogenesis. Science. 340 (6137), 1185-1189 (2013).
- Bosveld, F., et al. Mechanical control of morphogenesis by Fat/Dachsous/Four-jointed planar cell polarity pathway. Science. 336 (6082), 724-727 (2012).
- Farhadifar, R., Roper, J. C., Aigouy, B., Eaton, S., Julicher, F. The influence of cell mechanics, cell-cell interactions, and proliferation on epithelial packing. Curr. Biol. 17, 2095-2104 (2007).
- Rauzi, M., Verant, P., Lecuit, T., Lenne, P. F. Nature and anisotropy of cortical forces orienting Drosophila tissue morphogenesis. Nat. Cell Biol. 10, 1401-1410 (2008).
- Mitrossilis, D., et al. Real-time single-cell response to stiffness. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107 (38), 16518-16523 (2010).
- Irimia, D., Charras, G., Agrawal, N., Mitchison, T., Toner, M. Polar stimulation and constrained cell migration in microfluidic channels. Lab Chip. 12, 1783-1790 (2007).
- Fink, J., et al. External forces control mitotic spindle positioning. Nat. Cell. Biol. 13 (7), 771-778 (2011).
- Azioune, A., Storch, M., Bornens, M., Théry, M., Piel, M. Simple and rapid process for single cell micro-patterning. Lab Chip. 9 (11), 1640-1642 (2009).
- Azioune, A., Carpi, N., Tseng, Q., Théry, M., Piel, M. Protein micropatterns: A direct printing protocol using deep Uvs. Methods Cell Biol. 97, 133-146 (2010).
- Azioune, A., et al. Robust method for high-throughput surface patterning of deformable substrates. Langmuir. 27 (12), 7349-7352 (2011).
- Carpi, N., Piel, M., Azioun, A., Cuvelier, D., Fink, J. Micropatterning on silicon elastomer (PDMS) with deep UVs. Protoc. Exch. , (2011).
- Sinha, B., et al. Cells respond to mechanical stress by rapid disassembly of caveolae. Cell. 144 (3), 402-413 (2011).
