Undersøgelse af fagolysosomet Biogenese i Live makrofager
Abstract
Fagocytceller spiller en stor rolle i det medfødte immunsystem ved at fjerne og fjerne invaderende mikroorganismer i deres phagosomes. Phagosome modning er den komplekse og stramt reguleret proces, hvor en spirende phagosome undergår drastiske forvandling gennem veltilrettelagt interaktioner med forskellige cellulære organeller og rum i cytoplasmaet. Denne proces, som er afgørende for den fysiologiske funktion af fagocytceller ved at give phagosomes med deres lytiske og bakteriedræbende egenskaber, kulminerer i fusion af phagosomes med lysosomer og biogenese af phagolysosomes som anses for at være den sidste og afgørende fase af modning phagosomes. I denne rapport beskriver vi en live cell imaging metode til kvalitativ og kvantitativ analyse af den dynamiske proces lysosom at phagosome levering af indhold, der er kendetegnende for fagolysosomet biogenese. Denne fremgangsmåde bruger IgG-belagte mikrokugler som en model for phagocyTosis og fluoroforen-konjugeret dextranmolekyler som luminal lysosomal last probe, for at følge den dynamiske levering af lysosmal indhold til phagosomes i realtid i levende makrofager under anvendelse af time-lapse billeddannelse og konfokal laser scanning mikroskopi. Her beskriver detaljeret baggrunden, forberedelse trin og trin-for-trin forsøgsopstilling der gør det let og præcis indsættelse af denne metode i andre laboratorier. Vores beskrevne metode er enkel, robust, og vigtigst, kan let tilpasses til at studere phagosomal interaktioner og modning i forskellige systemer og under forskellige eksperimentelle indstillinger såsom anvendelse af forskellige fagocytceller typer, tab af funktion eksperimenter, forskellige sonder, og fagocytiske partikler.
Introduction
Professionelle fagocytter, herunder makrofager, spiller en afgørende i immunsystemet. Ud over at være den første linje i forsvaret i det medfødte immunsystem, de spiller også en afgørende rolle i aktivering af den adaptive immunitet gennem deres signalering og antigenpræsenterende rolle 1-3. Mens funktionen af professionelle fagocytter er mangesidet, phagosome modning er den kritiske rygraden i bakteriedræbende og antigenbehandling funktion af de professionelle fagocytter 4,5. Efter receptor medieret engulfment og optagelse af en fagocytisk mål, såsom bakterier, den spirende phagosome går gennem en kompleks og godt orkestreret sekvens af samspil og udvekslinger med rum i endocytiske nettet og flere andre cellulære organeller 6. Arten af de forbindelser, der udveksles med disse cellulære enheder samt regulering og timingen af fusionsbegivenheder bestemmer luminale phagosomal miljø og phagosOMAL sammensætning membran og dermed 7 skæbne modning phagosome 8.
Den fysiologiske relevans af phagosome modning er eksemplificeret ved de forskellige strategier, som forskellige intracellulære patogener at flygte fra, arrestation eller undergrave phagosome modning 9. De fleste af disse strategier direkte eller indirekte forhindre endelig og kritisk fase af phagosome modningsproces: fusion af phagosome med sene endosomale / lysosomale rum, der forlener dem med hovedparten af hydrolytiske enzymer og anti-bakterielle faktorer af en moden phagosome 7 , 8,10. Analyse af den sidste kritiske skridt kan derfor give os stærke indikatorer om tilstanden af modningen af phagosomes og hvis den naturlige fysiologiske tilstand bliver positivt eller negativt påvirket under de særlige eksperimentelle indstillinger, der bliver udnyttet.
Den sene endosomale / lysosomale rums er generelt anses for at være de terminale rum i endocytiske proces, defineret og adskiller sig fra de tidlige endocytiske rum ved tilstedeværelsen af forskellige, Stage specifikke markørmolekyler. For eksempel hydrolytiske enzymer eller membran komponenter såsom Lysosomal associerede membranproteiner (lamper) blandt andre 11. Terminalen endocytisk rum-herefter blot kaldet lysosomer-også tjene som det vigtigste sted for de afsluttende faser af fordøjelse ved afslutningen af den fagocytære / endocytiske proces 12. På denne måde kan ufordøjelige sonder indlæses via endocytose og macropinocytosis fra den ekstracellulære miljø og transporteres gennem endocytiske vejen til lysosomer, hvor det ophobes 13,14 efter at have fulgt en klart defineret optagelse og jage. Fluorofor-konjugerede prober til fluorescensmikroskopi såsom organiske ufordøjelige polymer dextran er almindeligt anvendt som endocyticprobes 15-17.
<p class = "jove_content"> I denne metode beskriver vi udnyttelsen af IgG-belagte mikrokugler som fagocyterende last at undersøge phagosome modning ved at analysere levering af lysosomale luminale indhold til phagosomes. Ved hjælp af en fluorofor-konjugeret dextran sonde som en let påviselig markør for lysosomer i levende knoglemarv afledte makrofager (BMM) og time-lapse video billeddannelse med en konfokal laser scanning mikroskop, følger vi den dynamiske proces for gods i phagosomes med høj tidsmæssig opløsning. Vi derefter beskrive, hvordan de indsamlede time-lapse imaging data kan evalueres ved hjælp af open source og frit tilgængeligt billede analyse software, Fiji (eller ImageJ), statistisk analyseret ved hjælp af Microsoft Excel og præsenteres ved hjælp af GraphPad Prism software 14,18.Efter beskrivelsen af vores metode, kan analoge forsøg tilrettelægges med ændrede indstillinger og faktorer til at undersøge deres indflydelse på phagosome modning, næsten enhver othendes type af vedhængende primære eller celle-line fagocytceller, genetisk tab af funktion forsøg, herunder gen knock-out og knock-down, mutanter eller udtryk for fusionsproteiner, fagocytiske-mål, microbead coatingforbindelser, endosomale / lysosomale sonder og faktorer som et cytokiner, kemiske hæmmere eller siRNA blandt andre er alle variabler, der kan anvendes til den grundlæggende fremgangsmåde ved denne metode.
Vi definerer målet og de grundlæggende krav af denne metode som følger:
- Målet for metoden: at muliggøre direkte, kvantitativ og kvalitativ observation og analyse af phagosome modning med høj tidslig opløsning i levende fagocytceller.
- Fagocyterende last: En behørigt belagt mikropartikler eller biologisk mål. Her bruger vi IgG-coatede 3 um sfæriske polystyren mikropartikler, der let internaliseres via Fc-γ-receptor-medieret fagocytose. Alternativt kan mikroorganisme eller overtrukket microparticle for hvilke en fagocytisk receptor er til stede på de celler, kan anvendes.
- Fagocytiske celler: Adhærente fagocytiske celler, der udtrykker de relevante fagocytiske receptorer. Her bruger vi mus primære BMMs der rigeligt udtrykker Fc-γ-receptorer. Alternativt kunne dendritiske celler (DC), monocytter eller phagocytiske epitelceller eller deres genetiske mutanter eller knock-out varianter anvendes.
- Lysosomale last: En fluorescens-mærkede lysosomale sonde. Her Texas Red-konjugeret 70.000 kilodalton dextran (Dex70kD) anvendt som den luminale last af lysosomer. Alternativt kan fluorescens detekterbar markør af et cellulært rum eller organel eller en passende probe til phagosomal egenskaber såsom syre-eller nedbrydende kapacitet, kan anvendes til at studere udviklingen af phagosome modning.
- Faktorer: For eksempel signalmolekyler, kemiske forbindelser, gen knock-down, eller transient ekspression af mutant proteiner kunne. Her har vi FÖRGen brug af en sådan faktor for overskuelighedens skyld, men for et nyligt eksempel med mutant protein udtryk og knock-down påvirkende faktorer se Kasmapour et al. 18. Enhver faktor, der kan påvirke fagocytose eller omstændighederne og mobilitet phagosomes og / eller de rum, der interagerer med udløb phagosomes kunne potentielt anvendes.
Protocol
Representative Results
Discussion
I det følgende afsnit vil vi diskutere kritiske trin i den fremlagte metode og dens begrænsninger. Endvidere vil vi forbinde nogle af de almindelige problemer med deres løsninger, foretage eventuelle ændringer og overveje fordelene ved vores metode samt egnede supplerende metoder til denne tilgang.
Fremstillingen af perler, herunder koblingen af IgG til perlens overflade er afgørende, og brugen af unfresh præparater bør undgås. I tillæg til det, er det også afgør…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker medlemmer af fagosomet Laboratorium for kritisk læsning af manuskriptet. Dette arbejde understøttes af en Helmholtz Young Investigator tilskud (Initiativ og Netværk midler fra Helmholtz Association) og et prioriteret program SPP1580 Ydelse af forskningsrådet tysk (Deutsche Forschungsgemeinschaft, DFG).
Materials
| Dulbecco's Modified Eagles Medium (D-MEM) | PAA, Austria | E15-009 | |
| Dulbecco's Modified Eagles Medium without phenol red (D-MEM) | PAA, Austria | E15-047 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | PAA, Austria | A15-151 | |
| L-Glutamine | PAA, Austria | M11-004 | |
| PBS | PAA, Austria | H15-002 | |
| Penicillin/Streptomycin | PAA, Austria | P11-010 | |
| WillCo-dish® Glass bottom dish (35 mm ∅, #1.5) | WillCo Wells, Netherlands | GWSt-3522 | |
| CELLviewTM glass bottom dish, 35 mm | Greiner Bio one, Germany | 627871 | Alternative: Available as segmented |
| Carboxylated latex microspheres | Polysciences, USA | #09850 | Available in different diameters, we used 3 μm |
| Polystyrene microparticles | Kisker Biotech, Germany | PPs-3.0COOH | |
| Triton-X 100 | ROTH, Germany | 305.1.3 | |
| mouse whole IgG | Rockland, USA | 010-0102 | |
| EDAC crosslinker | Sigma-Aldrich, USA | E6383-1g | |
| 10 mM Tris | Sigma-Aldrich,USA | T1503 | |
| 1-ml syringe Omnifix -F | B.Braun, Germany | 9161406V | |
| 26 G needle (0.45*25 mm) | B.Baun, Germany | 4657683 | |
| RPMI 1640 | PAA, Austria | E15-039 | |
| Horse Serum | Gibco, USA | 16050-122 | |
| MES hydrate | Sigma-Aldrich, USA | M2933 | |
| 0.2 μM syringe mounted filter | Sartorius, Germany | 83.1826.001 |
References
- Greenberg, S., Grinstein, S. Phagocytosis and innate immunity. Curr. Opin. Immunol. 14, 136-145 (2002).
- Jutras, I., Desjardins, M. Phagocytosis: at the crossroads of innate and adaptive immunity. Ann. Rev. Cell Dev. Biol. 21, 511-527 (2005).
- Iwasaki, A., Medzhitov, R. Regulation of adaptive immunity by the innate immune system. Science. 327, 291-295 (2010).
- Stuart, L., Ezekowitz, R. Phagocytosis: elegant complexity. Immunity. 22, 539-550 (2005).
- Blander, J. M., Medzhitov, R. On regulation of phagosome maturation and antigen presentation. Nat. Immunol. 7, 1029-1035 (2006).
- Flannagan, R. S., Jaumouille, V., Grinstein, S. The cell biology of phagocytosis. Annu. Rev. Pathol. 7, 61-98 (2012).
- Vieira, O. V., Botelho, R. J., Grinstein, S. Phagosome maturation: aging gracefully. Biochem. J. 366, 689-704 (2002).
- Haas, A. The phagosome: compartment with a license to kill. Traffic. 8, 311-330 (2007).
- Flannagan, R. S., Cosio, G., Grinstein, S. Antimicrobial mechanisms of phagocytes and bacterial evasion strategies. Nat Rev Microbiol. 7, 355-366 (2009).
- Luzio, J., Pryor, P., Bright, N. Lysosomes: fusion and function. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 8, 622-632 (2007).
- Huotari, J., Helenius, A. Endosome maturation. EMBO J. 30, 3481-3500 (2011).
- Luzio, J. P., et al. Lysosome-endosome fusion and lysosome biogenesis. J. Cell. Sci. 113 (pt 9), 1515-1524 (2000).
- Eissenberg, L., Goldman, W. Fusion of lysosomes with phagosomes containing Histoplasma capsulatum: use of fluoresceinated dextran). Adv. Exp. Med. Biol. 239, 53-61 (1988).
- de Souza Carvalho, C., et al. Internalization, phagolysosomal biogenesis and killing of mycobacteria in enucleated epithelial cells. Cell. Microbiol. 13, 1234-1249 (2011).
- Wang, Y. L. Differential and sequential delivery of fluorescent lysosomal probes into phagosomes in mouse peritoneal macrophages. J. Cell Biol. 104, 1749-1754 (1987).
- Harrison, R. E., Bucci, C., Vieira, O. V., Schroer, T. A., Grinstein, S. Phagosomes Fuse with Late Endosomes and/or Lysosomes by Extension of Membrane Protrusions along Microtubules: Role of Rab7 and RILP. Mol. Cell. Biol. 23, 6494-6506 (2003).
- Huynh, K. K., et al. LAMP proteins are required for fusion of lysosomes with phagosomes. EMBO J. 26, 313-324 (2007).
- Kasmapour, B., Gronow, A., Bleck, C., Hong, W., Gutierrez, M. Size-dependent mechanism of cargo sorting during lysosome-phagosome fusion is controlled by Rab34. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 20485-20490 (2012).
- Snijder, B., et al. Population context determines cell-to-cell variability in endocytosis and virus infection. Nature. 461, 520-523 (2009).
- Knight, M., Roberts, S., Lee, D., Bader, D. Live cell imaging using confocal microscopy induces intracellular calcium transients and cell death. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 284, 9 (2003).
- Hemmi, H., et al. A Toll-like receptor recognizes bacterial DNA. Nature. 408, 740-745 (2000).
- Underhill, D., Ozinsky, A. Toll-like receptors: key mediators of microbe detection. Curr. Opin. Immunol. 14, 103-110 (2002).
- Bohdanowicz, M., Cosío, G., Backer, J., Grinstein, S. Class I and class III phosphoinositide 3-kinases are required for actin polymerization that propels phagosomes. J. Cell Biol. 191, 999-1012 (2010).
- Hoffmann, E., et al. Initial receptor-ligand interactions modulate gene expression and phagosomal properties during both early and late stages of phagocytosis. Eur. J. Cell Biol. 89, 693-704 (2010).
- Yates, R., Hermetter, A., Russell, D. The kinetics of phagosome maturation as a function of phagosome/lysosome fusion and acquisition of hydrolytic activity. Traffic. 6, 413-420 (2005).
- Savina, A., et al. NOX2 controls phagosomal pH to regulate antigen processing during crosspresentation by dendritic cells. Cell. 126, 205-218 (2006).
- Yates, R., Hermetter, A., Russell, D. Recording phagosome maturation through the real-time, spectrofluorometric measurement of hydrolytic activities. Methods Mol. Biol. 531, 157-171 (2009).
- Russell, D., Vanderven, B., Glennie, S., Mwandumba, H., Heyderman, R. The macrophage marches on its phagosome: dynamic assays of phagosome function. Nat. Rev. Immunol. 9, 594-600 (2009).
- Hoffmann, E., et al. Autonomous phagosomal degradation and antigen presentation in dendritic cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 14556-14561 (2012).
- Tan, S., Sukumar, N., Abramovitch, R., Parish, T., Russell, D. Mycobacterium tuberculosis Responds to Chloride and pH as Synergistic Cues to the Immune Status of its Host Cell. PLoS Pathog. 9, (2013).
- Aziz, M., Yang, W. -. L., Wang, P., Coliganet, J. E. Measurement of phagocytic engulfment of apoptotic cells by macrophages using pHrodo succinimidyl ester. Current protocols in immunology. 14, (2013).
- Rogers, L., Foster, L. The dynamic phagosomal proteome and the contribution of the endoplasmic reticulum. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 18520-18525 (2007).
- Russell, D. G., Vanderven, B. C., Glennie, S., Mwandumba, H., Heyderman, R. S. The macrophage marches on its phagosome: dynamic assays of phagosome function. Nat. Rev. Immunol. 9, 594-600 (2009).
- Savina, A., Vargas, P., Guermonprez, P., Lennon, A. -. M., Amigorena, S. Measuring pH, ROS production, maturation, and degradation in dendritic cell phagosomes using cytofluorometry-based assays. Methods. Mol. Biol. 595, 383-402 (2010).
