Фагоциты играют важную роль в системе врожденного иммунитета путем удаления и ликвидации вторжения микроорганизмов в их фагосом. Фагосомы созревание является сложным и жестко регулируется процесс, при котором зарождается Фагосомы претерпевает радикальные преобразования с помощью хорошо организованных взаимодействий с различных клеточных органелл и отсеков в цитоплазме. Этот процесс, который имеет важное значение для физиологической функции фагоцитирующих клеток по наделяя фагосом с их литических и бактерицидными свойствами, достигает кульминации в слиянии фагосом с лизосом и биогенеза фаголизосомах который считается последним и критический этап созревания для фагосом. В этом докладе мы описываем метод, основанный изображений живых клеток для качественного и количественного анализа динамического процесса лизосом в фагосомы Content Delivery, который является отличительной чертой фаголизосомы биогенеза. Этот подход использует микрошарики IgG-покрытые качестве модели для phagocytosis и флуорофорные-сопряженных декстрана молекулы как просвета лизосом грузов зонда, для того, чтобы следить за динамический доставки контента lysosmal к фагосом в режиме реального времени в живых макрофагов с помощью покадровой обработки изображений и конфокальной лазерной сканирующей микроскопии. Здесь мы подробно описать фон, подготовительные шаги и шаг за шагом экспериментальную установку для включения легко и точно развертывание этого метода в других лабораториях. Наша Описанный метод является простой, надежный, а главное, может быть легко адаптирована для изучения phagosomal взаимодействия и созревание в разных системах и при различных экспериментальных условиях, таких как использование различных типов фагоциты, с потерей функции экспериментов, различных датчиков, а фагоцитарные частиц.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Изучение фаголизосомы биогенеза в живых макрофагов
В этой статье
Аннотация
Введение
Профессиональные фагоциты, включая макрофаги, играют решающую роль в иммунной системе. Помимо того, что первая линия обороны в врожденной иммунной системы, они также играют важную роль в активации адаптивного иммунитета через их сигнализации и антигенпредставляющих роль 1-3. В то время как функция профессиональных фагоцитов многогранна, Фагосомы созревания является критическим основой бактерицидного и антигена функции обработки профессиональных фагоцитов 4,5. После опосредованного рецептором охвате и поглощения в фагоцитарной цели, такие как бактерии, возникающий Фагосомы проходит через сложную и хорошо организованной последовательности взаимоде....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Уход за животными и все процедуры в этом протоколе следуйте институциональных и национальных руководящих принципов.
Подготовьте препараты, которые указаны на "Π-" заранее.
1. Подготовка BMMs
- Выполнение отбраковывать мышей путем смещени шейных позвонков.
- Удалить бедра и голени кости, бесплатные кости из ткани и отделка оба конца для доступности костном мозге.
- Хранить кости в ледяной PBS или ледяной DMEM среде (не содержащей 100 Е / мл пенициллина и 100 мкг / мл стрептомицина, на льду до следующей стадии.
Примечание: Провести следующие шаги под шкафом класс ....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Правильная подготовка клеток и бусы для визуализации имеет решающее значение. Рисунок 1 показывает схему посева, зонда-погрузки и первых шагов изображений в этом методе, основанном на нашем оптимизированного протокола для BMMs. Поэтому крайне важно, что параметры протокола быть проверены и оптимизированы в зависимости от типа клеток и зондов, которые должны быть использованы.
После добавления IgG, покрытых шариков к предварительно загруженных клеток, важно, что поле зрения в.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
В следующем разделе мы обсудим важные этапы предложенного метода и его ограничения. Кроме того, мы подключим некоторые из распространенных проблем, с их решениями, ввести возможные изменения и рассмотреть преимущества нашего метода, а также подходящие дополнительные методы для этого подхода.
Приготовление шариков, в том числе сочетания IgG к поверхности шарика, имеет решающее значение, и использование несвежий препаратов следует избегать. В добавок к этому, она также имеет важное значение, ч.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы не имеют ничего раскрывать.
Благодарности
Мы благодарим членов биологической лаборатории фагосомы за критическое прочтение рукописи. Эта работа поддержана грантом Гельмгольца Молодая следователь (инициатива и Сетевые средств из Гельмгольца) и Программы Priority SPP1580 Грант немецкого исследовательского совета (Deutsche Forschungsgemeinschaft, DFG).
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Модифицированная среда Dulbecco's Eagles (D-MEM) | PAA, Австрия | E15-009 | |
| Модифицированная среда Dulbecco's Eagles без фенола красного (D-MEM) | PAA, Австрия | E15-047 | |
| Фетальная сыворотка крупного рогатого скота (FBS) | PAA, Австрия | A15-151 | |
| L-глутамин | PAA, Австрия | M11-004 | |
| PBS | PAA, Австрия | H15-002 | |
| Пенициллин/стрептомицин | PAA, Австрия | P11-010 | |
| WillCo-dish® Тарелка со стеклянным дном (35 мм &пусто;, #1.5) | WillCo Wells, Нидерланды | GWSt-3522 | |
| CELLviewTM, 35 мм | Greiner Bio one, Германия | 627871 | Альтернатива: Доступны в виде сегментированных |
| карбоксилированных латексных микросфер | Polysciences, США | #09850 | Доступны в разных диаметрах, мы использовали 3 μ m |
| Микрочастицы полистирола | Kisker Biotech, Германия | PPs-3.0COOH | |
| Triton-X 100 | ROTH, Германия | 305.1.3 | |
| мышь целая IgG | Rockland, США | 010-0102 | |
| EDAC сшивающий агент | Sigma-Aldrich, США | E6383-1g | |
| 10 mM Tris | Sigma-Aldrich,США | T1503 | |
| 1-мл шприц 1 мл Omnifix -F | B.Braun, Германия | 9161406V | |
| 26 Игла G (0,45*25 мм) | B.Baun, Германия | 4657683 | |
| RPMI 1640 | PAA, Австрия | E15-039 | |
| Сыворотка для лошадей | Gibco, США | 16050-122 | |
| MES гидрат | Sigma-Aldrich, США | M2933 | |
| 0,2 μ М шприц монтажный фильтр | Sartorius, Германия | 83.1826.001 |
Ссылки
- Greenberg, S., Grinstein, S. Phagocytosis and innate immunity. Curr. Opin. Immunol. 14, 136-145 (2002).
- Jutras, I., Desjardins, M. Phagocytosis: at the crossroads of innate and adaptive immunity. Ann. Rev. Cell Dev. Biol. 21, 511-527 (2005).
- Iwasaki, A., Medzhit....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
