Fagocytiske celler spiller en viktig rolle i det medfødte immunsystemet ved å fjerne og eliminere invaderende mikroorganismer i sine phagosomes. Phagosome modning er komplekse og tett regulert prosess der en gryende phagosome gjennomgår drastisk forvandling gjennom godt orkestrert interaksjoner med ulike cellulære organeller og oppbevaringsrom i cytoplasma. Denne prosessen, som er avgjørende for den fysiologiske funksjon av fagocytiske celler ved endowing phagosomes med sine lytiske og bakteriedrepende egenskaper, kulminerer i fusjon av phagosomes med lysosomer og biogenesis av phagolysosomes som anses å være den siste og avgjørende fasen av modning for phagosomes. I denne rapporten beskriver vi en levende celle bildebehandling basert metode for kvalitativ og kvantitativ analyse av dynamisk prosess med lysosome å phagosome innhold levering, noe som er et kjennetegn på phagolysosome biogenesis. Denne fremgangsmåten anvender IgG-belagte mikroperler som en modell for phagocyTosis og fluoroforen-konjugert dekstran-molekyler som luminal lysosomal last probe, for å kunne følge den dynamiske levering av lysosmal innholdet til de phagosomes i sanntid i levende makrofager ved hjelp av time-lapse avbildning og konfokal laser-skanning mikroskopi. Her beskriver vi i detalj bakgrunnen, forberedelsestrinnene og trinn-for-trinn eksperimentelt oppsett som gir enkel og presis distribusjon av denne metoden i andre laboratorier. Vår beskrevet metoden er enkel, robust, og viktigst, kan enkelt tilpasses for å studere phagosomal interaksjoner og modning i ulike systemer og under ulike eksperimentelle innstillinger som bruk av ulike fagocytiske celler typer, tap-av-funksjon eksperimenter, ulike prober, og fagocyttiske partikler.
Profesjonelle fagocytter, inkludert makrofager, spille en avgjørende i immunsystemet. I tillegg til å være den første linjen i forsvaret i det medfødte immunsystem, de spiller også en avgjørende rolle i aktivering av adaptiv immunitet gjennom deres signalering og antigenpresenterende rolle 1-3. Mens funksjon av profesjonelle fagocytter er mangefasettert, er phagosome modning den kritiske ryggraden i bakteriedrepende og antigen prosessering funksjon av de profesjonelle fagocytter 4,5. Ved å reseptor mediert engulfment og opptak av en fagocytisk mål, slik som bakterier, går den begynnende phagosome gjennom en kompleks og velorganisert sekvens av interaksjon og utvekslingen med avdelinger av endocytic nettverk og flere andre cellulære organeller 6. Naturen av forbindelsene utvekslet med disse cellulære enheter samt regulering og timingen av fusjonshendelser bestemmer luminal phagosomal miljøet og de phagosomal membran sammensetning og dermed 7, skjebnen til modning phagosome åtte.
Den fysiologiske betydningen av phagosome modning er eksemplifisert ved de ulike strategier ansatt av ulike intracellulære patogener å flykte fra, arrestere eller grave phagosome modning ni. De fleste av disse strategiene er direkte eller indirekte hindre at den siste og avgjørende trinn i phagosome modningsprosess: fusjon av phagosome med sen endosomal / lysosomale rom, hvilket endows dem med hoveddelen av hydrolytiske enzymer og anti-bakterielle faktorer for et modent phagosome 7 , 8,10. Analyse av denne endelige og avgjørende skritt kan derfor gi oss sterke indikatorer om tilstanden i modningen av phagosomes og hvis den naturlige fysiologiske tilstand er å være positivt eller negativt påvirket under spesielle eksperimentelle innstillinger som blir utnyttet.
Den avdøde endosomal / lysosomal rommets er generelt ansett for å være de terminal avdelinger av endocytoseveien, definert og aner fra tidlig endocytiske avdelinger ved tilstedeværelse av ulike, scene spesifikke, markør molekyler. For eksempel hydrolytic enzymer eller membrankomponenter som Lysosomal assosiert membran proteiner (lamper) blant andre 11. Terminalen endocytic avdelinger-heretter bare kalt lysosomer-også tjene som den viktigste plasseringen for sluttfasen av fordøyelsen ved utgangen av fagocyttisk / endocytoseveien 12. På denne måte kan ikke-fordøyelige prober bli lastet via endocytose og macropinocytosis fra det ekstracellulære miljø og transportert gjennom endocytoseveien til lysosomene hvor det akkumuleres 13,14 etter å ha fulgt en definert syklus av opptak og jakten. Fluoroforpar-konjugert prober for fluoriserende mikroskopi som den organiske fordøyelige polymer dekstran blir ofte brukt som endocyticprobes 15-17.
<p class = "jove_content"> I denne metoden, beskriver vi bruken av IgG-belagte mikroperler som fagocytisk lasten for å undersøke phagosome modning ved å analysere levering av lysosomal luminale innhold til phagosomes. Ved å bruke en fluoroforen-konjugert dekstran sonde som et lett påviselig markør Lysosomers i levende benmarg avledet makrofager (BMM) og time-lapse video bildebehandling med en confocal laser-scanning mikroskop, følger vi den dynamiske prosessen med last levering i phagosomes med høy tidsmessig oppløsning. Vi beskriver deretter hvordan de innsamlede time-lapse imaging data kan evalueres ved hjelp av åpen kildekode og fritt tilgjengelig programvare for bildeanalyse, Fiji (eller ImageJ), analysert statistisk ved hjelp av Microsoft Excel og presentert ved hjelp av GraphPad Prism programvare 14,18.Etter beskrivelsen av foreliggende fremgangsmåte kan analoge eksperimenter være utformet ved bruk av modifiserte innstillinger og forhold for å undersøke deres innflytelse på phagosome modning, praktisk talt en hvilken som helst othennes type heft primære eller celle linjer fagocytiske celler, genetisk tap av funksjons eksperimenter inkludert genet knock-out og knock-down, mutanter eller uttrykk for fusjonsproteiner, fagocyttiske-mål, microbead belegg forbindelser, endosomal / lysosomale prober og faktorer som en cytokiner, kjemiske hemmere, eller siRNA blant andre er alle variabler som kan brukes til grunnleggende tilnærming av denne metoden.
Vi definerer mål og de grunnleggende kravene i denne metoden som følger:
I neste avsnitt vil vi diskutere kritiske trinn av det presenterte metoden og dens begrensninger. Videre vil vi koble noen av de vanligste problemene med sine løsninger, introdusere mulige modifikasjoner og vurdere fordelene med vår metode samt egnede komplementære metoder for denne tilnærmingen.
Fremstillingen av kulene, blant annet koblingen av IgG til perleoverflaten, er avgjørende, og bruken av unfresh preparater bør unngås. I tillegg til det, er det også avgjørende at dekstran …
The authors have nothing to disclose.
Vi takker medlemmene av phagosome Biology Laboratory for kritisk lesing av manuskriptet. Dette arbeidet støttes av en Helmholtz Young Investigator Grant (Initiative og Nettverk midler av Helmholtz Association) og en Priority Program SPP1580 Grant av den tyske Research Council (Deutsche Forschungsgemeinschaft, DFG).
Dulbecco's Modified Eagles Medium (D-MEM) | PAA, Austria | E15-009 | |
Dulbecco's Modified Eagles Medium without phenol red (D-MEM) | PAA, Austria | E15-047 | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | PAA, Austria | A15-151 | |
L-Glutamine | PAA, Austria | M11-004 | |
PBS | PAA, Austria | H15-002 | |
Penicillin/Streptomycin | PAA, Austria | P11-010 | |
WillCo-dish® Glass bottom dish (35 mm ∅, #1.5) | WillCo Wells, Netherlands | GWSt-3522 | |
CELLviewTM glass bottom dish, 35 mm | Greiner Bio one, Germany | 627871 | Alternative: Available as segmented |
Carboxylated latex microspheres | Polysciences, USA | #09850 | Available in different diameters, we used 3 μm |
Polystyrene microparticles | Kisker Biotech, Germany | PPs-3.0COOH | |
Triton-X 100 | ROTH, Germany | 305.1.3 | |
mouse whole IgG | Rockland, USA | 010-0102 | |
EDAC crosslinker | Sigma-Aldrich, USA | E6383-1g | |
10 mM Tris | Sigma-Aldrich,USA | T1503 | |
1-ml syringe Omnifix -F | B.Braun, Germany | 9161406V | |
26 G needle (0.45*25 mm) | B.Baun, Germany | 4657683 | |
RPMI 1640 | PAA, Austria | E15-039 | |
Horse Serum | Gibco, USA | 16050-122 | |
MES hydrate | Sigma-Aldrich, USA | M2933 | |
0.2 μM syringe mounted filter | Sartorius, Germany | 83.1826.001 |