Plataforma de microfluidos para la medición de quimiotaxis de neutrófilos a partir de sangre entera sin procesar
Summary
Este protocolo detalla un ensayo diseñado para medir la quimiotaxis de neutrófilos humanos a partir de una gotita de sangre entera con robusta reproducibilidad. Este enfoque evita la necesidad de la separación de neutrófilos y requiere sólo unos pocos minutos de ensayo de tiempo de preparación. El chip de microfluidos permite la medición repetida de la quimiotaxis de neutrófilos en el tiempo en los bebés o pequeños mamíferos, donde el volumen de la muestra es limitado.
Abstract
Los neutrófilos desempeñan un papel esencial en la protección contra las infecciones y sus números en la sangre se miden con frecuencia en la clínica. Altos recuentos de neutrófilos en la sangre suelen ser un indicador de las infecciones en curso, mientras que los recuentos bajos de neutrófilos son una señal de advertencia para los mayores riesgos para las infecciones. Para llevar a cabo sus funciones, los neutrófilos también tienen que ser capaces de moverse con eficacia de la sangre donde pasan la mayor parte de su vida, en los tejidos, en los que se producen las infecciones. En consecuencia, cualquier defecto en la capacidad de los neutrófilos para migrar pueden aumentar los riesgos de infecciones, incluso cuando los neutrófilos están presentes en números apropiados en la sangre. Sin embargo, la medición de la capacidad de migración de los neutrófilos en la clínica es una tarea difícil, que requiere tiempo, requiere gran volumen de sangre, y el conocimiento de expertos. Para hacer frente a estas limitaciones, hemos diseñado un robusto análisis de microfluidos para la migración de neutrófilos, que requiere una sola gota de sangre no procesada, circumrespiraderos la necesidad de la separación de neutrófilos, y es fácil de cuantificar en un microscopio sencillo. En este ensayo, los neutrófilos migran directamente de la gota de sangre, a través de pequeños canales, hacia la fuente de quimioatrayente. Para evitar que el flujo granular de células rojas de la sangre a través de los mismos canales, se implementó filtros mecánicos con ángulo de giros a la derecha que bloquean selectivamente el avance de las células rojas de la sangre. Hemos validado el ensayo comparando la migración de neutrófilos a partir de gotas de sangre de pinchazo en el dedo y la sangre venosa. También comparamos todo esto en la sangre (WB) con fuentes de la migración de neutrófilos a partir de muestras de neutrófilos purificados y encontramos la velocidad constante y direccionalidad entre las tres fuentes. Esta plataforma de microfluidos permitirá el estudio de la migración de neutrófilos humanos en la clínica y el marco de la investigación para ayudar a avanzar nuestra comprensión de las funciones de los neutrófilos en la salud y la enfermedad.
Introduction
El tráfico de neutrófilos juega un papel crítico en la determinación del progreso y la resolución de muchas condiciones inflamatorias, incluyendo la aterosclerosis 1, la infección bacteriana o la sepsis 2, y lesiones por quemadura 3. Por su importante contribución a las condiciones de salud y enfermedad, el recuento de neutrófilos es parte del análisis de sangre estándar a menudo se considera en los laboratorios clínicos y de investigación. Sin embargo, a pesar de ser una de las pruebas más ubicuos, el valor de recuento de neutrófilos en el diagnóstico de la infección y la sepsis se ha cuestionado con frecuencia 4. Por ejemplo, un estudio de los neutrófilos en pacientes con quemaduras reveló que el recuento de neutrófilos y la función de la migración de neutrófilos no se correlacionan; lo que significa que el recuento de neutrófilos por sí sola no es un indicador preciso del estado inmunológico 3. Aunque más difícil de medir, la competencia funcional de neutrófilos ha sido propuesta como más valioso en una amplia gama de condiciones.
t "> Es importante destacar que muchos de los defectos de neutrófilos son transitorias y no se activan por defectos genéticos permanentes, una distinción que se ha pasado por alto en gran medida en la clínica hasta hace poco. En el contexto de las lesiones por quemaduras, la migración de neutrófilos podría ser monitoreado durante el curso de tratamiento de un paciente como un indicador de estado inflamatorio o infección 3. ensayos de migración tradicionales utilizados actualmente en el laboratorio (cámara de Boyden, cámara de Dunn, ensayo de micropipeta) no se puede traducir en un entorno clínico, ya que requieren grandes volúmenes de sangre y engorroso que consume tiempo técnicas de aislamiento de neutrófilos (Tabla 1). Estos ensayos también pueden no ser usados para monitorear los cambios transitorios en la quimiotaxis de neutrófilos en pequeños animales de laboratorio, tales como ratones, ya que el volumen de sangre necesaria para el aislamiento de neutrófilos permite sólo una muestra y, a menudo incluso requiere la puesta en común de sangre de múltiples animales para un único ensayo. Por ejemplo, un estudio que implicaba mcondiciones ultiple y tratamientos a través de múltiples puntos de tiempo potencialmente podrían requerir miles de ratones utilizando ensayos de quimiotaxis actuales. Esto restringe la investigación biológica básica que se puede hacer para comprender la compleja dinámica de la función inmune en el contexto de una lesión, infección o quemadura frecuentemente estudiado en los modelos murinos 5.Para abordar la necesidad de un ensayo funcional de neutrófilos que es rápido, robusto, mientras que requiere un mínimo de volumen de sangre, hemos desarrollado un dispositivo de microfluidos que mide la quimiotaxis de neutrófilos directamente desde una pequeña gota de sangre entera. Se sabe que muchos factores en la sangre entera, incluyendo suero 6 y 7 plaquetas, afectan a la función de los neutrófilos. Por lo tanto, es beneficioso que todo el ensayo microfluídico sangre minimiza procesamiento de la muestra para mantener el microambiente in vivo de los neutrófilos en la medición de las variaciones en la quimiotaxis con un ensayo in vitro 8. Este enfoquereduce el tiempo de recogida de sangre para ensayos de migración de neutrófilos de horas utilizando técnicas tradicionales, a pocos minutos (Tabla 1). La plataforma de microfluidos sangre completa produce un gradiente lineal quimioatrayente estable para la duración del experimento, no tiene partes móviles, y no requiere una fuente de presión externa (es decir, bomba de jeringa). La característica clave en el diseño de todo el dispositivo de microfluidos sangre es la incorporación de un glóbulo rojo (RBC) de peine de filtración que filtra mecánicamente los glóbulos rojos de entrar en el canal de la migración del dispositivo. Los giros a la derecha de este peine filtración evitan la necesidad de filtración de exclusión de tamaño, lo que probablemente se atasca con los glóbulos rojos y por lo tanto bloquean el gradiente quimiotáctico de alcanzar los neutrófilos migran activamente en el BM. La incorporación de todo el dispositivo de microfluidos sangre en una placa de 12 o 24 pocillos facilita la detección de múltiples mediadores de Si la quimiotaxis de neutrófilos humana o murinasimultáneamente.
Protocol
Representative Results
Discussion
En este trabajo, hemos desarrollado una plataforma de microfluidos para medir la quimiotaxis de neutrófilos a partir de una gota de sangre (2 l). La filtración mecánica en el chip de los glóbulos rojos de la migración de neutrófilos activamente evita la necesidad de métodos engorrosos de separación de células tales como gradientes de densidad 10, la selección positiva 11, o selección negativa 12, que son propensos a introducir artefactos mediante la activación de los neutróf…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
El apoyo de los Institutos Nacionales de Salud (otorga GM092804, DE019938) y el Hospital Shriners Burns.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Device Fabrication | |||
| SU8 | Microchem | Y131273 | |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Ellsworth Adhesives | Sylgard 184 1.1 lb. Kit | |
| Standard glass slides | Fisher Scientific | 125495 | 1 X 3 inches |
| Glass-bottom plate | MatTek | P12G-1.5-14-F | |
| Harris Uni-Core, Tip Diameter 5.0mm | Ted Pella, Inc. | 15081 | |
| Harris Uni-Core, Tip Diameter 1.5 mm | Ted Pella, Inc. | 15072 | |
| Microfluidic Assay Preparation and Analysis | |||
| Gel-loading pipet tip | Fisher Scientific | 02-707-139 | |
| Syringe | Fisher Scientfic | 309602 | |
| Blunt tip needle, 30g ½ in. | Brico Medical Supply | BN3005 | |
| Vacutainer, Heparin | Becton Dickinson | ||
| HBSS | Sigma-Aldrich | ||
| Human serum albumin | Sigma-Aldrich | A5843-5G | 0.2% final concentration in HBSS |
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F0895-1MG | |
| fMLP | Sigma-Aldrich | F3506-10MG | |
| SurgiLance safety lancet, 2.2mm depth, 22 gauge | SLN240 | ||
| Hoescht stain | Life Technologies | H3570 | |
| Positive Control | |||
| HetaSep | STEMCELL Technologies Inc. | 7906 | |
| EasySep Human Neutrophil Enrichment Kit | STEMCELL Technologies Inc. | 19257 | |
| Equipment | |||
| Plasma Asher | March Instruments | P-250 | |
| Lindberg/Blue M Oven | Thermo Scientific | 13-258-30C | |
| Stainless Steel Precision Tweezers | Techni Tool | 758TW458 | |
| Bel-Art Scienceware Chemical-Resistant Vacuum Desiccator | Fisher Scientific | 08-594-15A | |
| Dataplate Digital Hot Plate | Alpha Multiservices | PMC 720 | |
| Nikon TiE inverted microscope | Nikon – Micro Video Instruments Inc. | MEA53100 | |
| CFI Plan Fluor DL 10x na 15.2wd Objective | Nikon – Micro Video Instruments Inc. | MRH20101 | |
| Lumen 200 with 2 Meter Light Guide for Nikon | Nikon – Micro Video Instruments Inc. | 500-L200NI2 | |
| DAPI/Hoechst/AMCA Narrow Band 32mm Exciters – 25mm Emitters | Chroma – Micro Video Instruments Inc. | 31013v2 | |
| Retiga R 2000 cooled CCD Camera 1600×1200 pixels | Qimaging – Micro Video Instruments Inc. | RET-2000R-F-M-12-C |
References
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