İşlenmemiş kandan Nötrofil Kemotaksis Ölçüm mikroakışkan Platformu
Summary
Bu protokol, sağlam tekrarlanabilirlik ile, bütün haldeki kan, bir damla, insan nötrofil kemotaksisi ölçmek için tasarlanmış bir tahlil göstermektedir. Bu yaklaşım, nötrofil ayrılması için ihtiyaç dışı eden ve deney hazırlama zaman sadece birkaç dakika gerektirir. Mikroakışkan çip bebeklerde veya örnek hacmi sınırlıdır küçük memeliler, zamanla nötrofil kemotaksisinin tekrarlanan ölçü sağlar.
Abstract
Nötrofiller kanda enfeksiyonları ve sayıları karşı korunmada önemli bir rol oynamaktadır sıklıkla klinikte ölçülür. Düşük nötrofil enfeksiyonlar için yüksek riskler için bir uyarı işareti ise kandaki yüksek nötrofil, genellikle devam eden enfeksiyonların bir göstergesidir. Görevlerini başarmak için, nötrofiller de enfeksiyonları oluşabilir dokulara, hayatlarının çoğunu kandan etkili hareket edebilmek için var. Sonuç olarak, göç nötrofillerin yeteneğinde herhangi bir kusur nötrofiller kanda uygun bir sayıda mevcut olsa bile, enfeksiyon risklerini artırabilir. Ancak, klinikte nötrofil göç yeteneğini ölçmek, zaman alıcı, zor bir görev, bir büyük kan hacmi, ve uzman bilgi gerektirir. Bu sınırlamaları çözmek için, çevresi, işlenmemiş kan tek bir damlacık gerektirir, nötrofil göçü için sağlam bir mikroakışkan tahlilleri tasarlanmıştırnötrofil ayrılması için ihtiyaç delikleri, ve bir basit mikroskop ölçmek kolaydır. Bu deneyde, nötrofil kemoatraktan kaynağına doğru, küçük kanallar aracılığıyla, kan damlacık tarafından doğrudan geçiş. Aynı kanallardan kırmızı kan hücrelerinin granül akışını önlemek için, seçici olarak, kırmızı kan hücrelerinin ilerlemesini bloke eden döner dik açı ile mekanik filtreler uygulanmıştır. Biz parmak prick ve venöz kandan toplanan kan damlacıklarının nötrofil göçü karşılaştırarak tahlil valide. Biz de saflaştırılmış Nötrofillerin örneklerinden nötrofil göçü ile bu tam kan (WB) kaynaklar karşılaştırılmış ve üç kaynaklar arasında tutarlı hız ve yönlendirme bulundu. Bu mikroakışkan platformu sağlık ve hastalık nötrofil fonksiyonlarının anlayışımızı ilerletmek yardımcı olmak için klinik ve araştırma ortamında insan nötrofil göç çalışmayı sağlayacaktır.
Introduction
Nötrofil kaçakçılığı ateroskleroz 1, bakteriyel enfeksiyon veya sepsis 2 de dahil olmak üzere birçok enflamatuar koşulları, ilerleme ve çözünürlüğü belirlenmesinde önemli bir rol oynar, ve yaralanma 3 yakmak. Sağlık ve hastalık onların büyük katkılarından dolayı, nötrofil sayısı sıklıkla klinik ve araştırma laboratuvarlarında kabul standart kan analizinin bir parçasıdır. Ancak, en her yerde testlerden biri, enfeksiyon ve sepsis tanısında nötrofil sayısının değerini olmasına rağmen sık sık 4 sorgulanmıştır. Örneğin, yanık hastalarda nötrofil bir çalışma nötrofil sayısı ve nötrofil göç fonksiyon ilişkili olmadığı ortaya; nötrofil yalnız saymak anlamına bağışıklık durumu 3 doğru bir göstergesi değildir. Ölçülmesi daha zor olsa da, nötrofil fonksiyonel yetenek koşullarının geniş bir aralıkta daha değerli olarak önerilmiştir.
t "> En önemlisi, nötrofil kusurları birçok geçici ve kalıcı genetik bozukluklar, büyük ölçüde yakın zamana kadar klinikte göz ardı edilmiş bir ayrım tarafından tetiklenen değildir. yanık yaralanmaları bağlamında, nötrofil göç sırasında takip edilebilir enflamatuar durum ya da enfeksiyona 3 bir göstergesi olarak bir hastanın tedavi bunlar kan geniş hacimli gerektirdiğinden. şu laboratuarda (Boyden haznesi Dunn odası, mikropipet deney) kullanılan geleneksel göç deneyler, klinik bir ortamda çevrilemeyen ve hantal zaman alıcıdır nötrofil izolasyon için gerekli kan hacmi sadece bir örnek için izin veren ve çoğu zaman da havuzu gerektirir, çünkü nötrofil izolasyon teknikleri (Tablo 1). Bu deneyler, aynı zamanda, örneğin, fare gibi küçük laboratuar hayvanları, nötrofil kemotaksis, geçici değişiklikleri izlemek için kullanılamaz Tek bir deney için, çok sayıdaki hayvandan alınan kan. Örneğin, ilgili bir çalışma mBirden çok zaman puan üzerinden ultiple koşulları ve tedaviler potansiyel mevcut kemotaksı deneyleri kullanılarak farelerin binlerce gerektirebilir. Bu hasar, enfeksiyon bağlamında bağışıklık fonksiyonunun karmaşık dinamiklerini anlamak ya da çoğu sıçangil modellerinde 5 incelenmiştir yakmak için yapılabilir temel biyolojik araştırmaları kısıtlar.Az kan hacmi gerektiren süre, hızlı sağlam bir nötrofil fonksiyonel tahlil için ihtiyacı karşılamak için, biz tam kan küçük bir damlacık doğrudan nötrofil kemotaksisini ölçen bir mikroakışkan cihaz geliştirdik. Bu serum 6 ve 7 de dahil olmak üzere platelet tüm kan içinde bir çok faktör, nötrofil fonksiyonunu etkileyen bilinmektedir. Bu, bütün kan mikroakışkan deney, bir in vitro deneyi ile 8 kemotaksis değişimlerin ölçülmesi sırasında nötrofil in vivo mikro korumak için örnek işleme en aza indirir bu nedenle faydalıdır. Bu yaklaşım, kan toplama geleneksel teknikleri kullanarak saatler nötrofil geçiş deneyleri için süreyi azaltır sadece birkaç dakika (Tablo 1). Tam kan mikroakışkan platformu, deney uzunluğu için sabit bir doğrusal gradyan kemoatraktan üreten hareketli parça ve bir dış basınç kaynağı (örn. şırınga pompası) gerektirmez. Tam kan mikroakışkan cihazın tasarımında önemli özelliği mekanik cihazın göç kanalı girmesini RBCs filtreleyen bir kırmızı kan hücresi (RBC) filtrasyon tarak birleşme olduğunu. Bu filtrasyon tarağın doğru dönüşleri muhtemel eritrosit ile tıkanmış olacağını boyut dışlama filtrasyon, ihtiyacını engeller ve bu nedenle de aktif WB göç nötrofil kemoatraktan ulaşmasını gradyanı bloke eder. 12 ya da 24 oyuklu bir plaka içerisinde, bütün kan mikroakışkan cihazın birleşme insan veya murin nötrofil kemotaksis si birden aracılarının tarama kolaylaştırırmultaneously.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu çalışmada, kan bir damlacık (2 ul) nötrofil kemotaksisini ölçmek için microfluidic platform geliştirdi. Aktif nötrofiller göç gelen RBCs on-chip mekanik filtrasyon nötrofiller aktive ederek eserleri tanıtmak eğilimli olan bu tür yoğunluk 10 eğimleri gibi hantal hücre ayırma yöntemleri, olumlu seçimi 11 veya negatif seçimi 12, ihtiyacını circumvents. RBCs mekanik filtrasyon nötrofil göçü sondalama diğer mikroakışkan cips teknoloji ayırır. Örneğin, la…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ulusal Sağlık Enstitüleri Destek ve Shriners Burns Hastanesi (GM092804, DE019938 verir).
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Device Fabrication | |||
| SU8 | Microchem | Y131273 | |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Ellsworth Adhesives | Sylgard 184 1.1 lb. Kit | |
| Standard glass slides | Fisher Scientific | 125495 | 1 X 3 inches |
| Glass-bottom plate | MatTek | P12G-1.5-14-F | |
| Harris Uni-Core, Tip Diameter 5.0mm | Ted Pella, Inc. | 15081 | |
| Harris Uni-Core, Tip Diameter 1.5 mm | Ted Pella, Inc. | 15072 | |
| Microfluidic Assay Preparation and Analysis | |||
| Gel-loading pipet tip | Fisher Scientific | 02-707-139 | |
| Syringe | Fisher Scientfic | 309602 | |
| Blunt tip needle, 30g ½ in. | Brico Medical Supply | BN3005 | |
| Vacutainer, Heparin | Becton Dickinson | ||
| HBSS | Sigma-Aldrich | ||
| Human serum albumin | Sigma-Aldrich | A5843-5G | 0.2% final concentration in HBSS |
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F0895-1MG | |
| fMLP | Sigma-Aldrich | F3506-10MG | |
| SurgiLance safety lancet, 2.2mm depth, 22 gauge | SLN240 | ||
| Hoescht stain | Life Technologies | H3570 | |
| Positive Control | |||
| HetaSep | STEMCELL Technologies Inc. | 7906 | |
| EasySep Human Neutrophil Enrichment Kit | STEMCELL Technologies Inc. | 19257 | |
| Equipment | |||
| Plasma Asher | March Instruments | P-250 | |
| Lindberg/Blue M Oven | Thermo Scientific | 13-258-30C | |
| Stainless Steel Precision Tweezers | Techni Tool | 758TW458 | |
| Bel-Art Scienceware Chemical-Resistant Vacuum Desiccator | Fisher Scientific | 08-594-15A | |
| Dataplate Digital Hot Plate | Alpha Multiservices | PMC 720 | |
| Nikon TiE inverted microscope | Nikon – Micro Video Instruments Inc. | MEA53100 | |
| CFI Plan Fluor DL 10x na 15.2wd Objective | Nikon – Micro Video Instruments Inc. | MRH20101 | |
| Lumen 200 with 2 Meter Light Guide for Nikon | Nikon – Micro Video Instruments Inc. | 500-L200NI2 | |
| DAPI/Hoechst/AMCA Narrow Band 32mm Exciters – 25mm Emitters | Chroma – Micro Video Instruments Inc. | 31013v2 | |
| Retiga R 2000 cooled CCD Camera 1600×1200 pixels | Qimaging – Micro Video Instruments Inc. | RET-2000R-F-M-12-C |
References
- Hansson, G. K., Robertson, A. K., Soderberg-Naucler, C. Inflammation and atherosclerosis. Annual review of pathology. 1, 297-329 (2006).
- Phillipson, M., Kubes, P. The neutrophil in vascular inflammation. Nature medicine. 17, 1381-1390 (2011).
- Butler, K. L., et al. Burn injury reduces neutrophil directional migration speed in microfluidic devices. PloS one. 5, (2010).
- Lavrentieva, A., et al. Inflammatory markers in patients with severe burn injury. What is the best indicator of sepsis. Burns : journal of the International Society for Burn Injuries. 33, 189-194 (2007).
- De Filippo, K., et al. Mast cell and macrophage chemokines CXCL1/CXCL2 control the early stage of neutrophil recruitment during tissue inflammation. Blood. 121, 4930-4937 (2013).
- Mankovich, A. R., Lee, C. Y., Heinrich, V. Differential effects of serum heat treatment on chemotaxis and phagocytosis by human neutrophils. PloS one. 8, (2013).
- Palabrica, T., et al. Leukocyte accumulation promoting fibrin deposition is mediated in vivo by P-selectin on adherent platelets. Nature. 359, 848-851 (1992).
- Sackmann, E. K., et al. Microfluidic kit-on-a-lid: a versatile platform for neutrophil chemotaxis assays. Blood. 120, (2012).
- Jones, C. N., et al. Microfluidic chambers for monitoring leukocyte trafficking and humanized nano-proresolving medicines interactions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 20560-20565 (2012).
- Nauseef, W. M. Isolation of human neutrophils from venous blood. Methods Mol Biol. 412, 15-20 (2007).
- Lyons, P. A., et al. Microarray analysis of human leucocyte subsets: the advantages of positive selection and rapid purification. BMC genomics. 8, (2007).
- Hasenberg, M., et al. Rapid immunomagnetic negative enrichment of neutrophil granulocytes from murine bone marrow for functional studies in vitro and in vivo. PloS one. 6, (2011).
- Agrawal, N., Toner, M., Irimia, D. Neutrophil migration assay from a drop of blood. Lab on a chip. 8, 2054-2061 (2008).
- Hoang, A. N., et al. Measuring neutrophil speed and directionality during chemotaxis, directly from a droplet of whole blood. Technology. , 1-9 (2013).
- Kurihara, T., et al. Resolvin D2 restores neutrophil directionality and improves survival after burns. FASEB journal : official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. , (2013).
- Buffone, V., Meakins, J. L., Christou, N. V. Neutrophil function in surgical patients. Relationship to adequate bacterial defenses. Arch Surg. 119, 39-43 (1984).
- Malawista, S. E., de Boisfleury Chevance, A., van Damme, J., Serhan, C. N. Tonic inhibition of chemotaxis in human plasma. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 17949-17954 (2008).
