רגישות סמים של adenylyl cyclase: התייעלות Assay ומזעור למולקולה קטנה ויישומים הקרנת siRNA
Summary
הפעלה מתמדת של תוצאות מעכבות G-חלבון בשילוב קולטנים ברגישות של איתות cyclase adenylyl. כדי לזהות את המסלולים מולקולריים החיוניים, גישות nonbiased נחוצות, עם זאת, אסטרטגיה זו מחייבת הפיתוח של assay רגישות cAMP מבוסס תאים ניתן להרחבה. בזאת, אנו מתארים assay רגישות למולקולה קטנה והקרנת siRNA.
Abstract
רגישות של cyclase adenylyl איתות (AC) הייתה מעורבת במגוון רחב של הפרעות נוירופסיכיאטריות ונוירולוגיות, כולל שימוש בסמים ומחלת פרקינסון. הפעלה חריפה של / קולטנים צמודים o Gαi מעכבת את פעילות AC, ואילו הפעלה מתמשכת של תוצאות קולטנים אלה ברגישות Heterologous של AC ורמות מוגברות של cAMP התוך התאי. שמחקרים קודמים הוכיחו כי שיפור זה של היענות AC הוא ציין הן במבחנה in vivo לאחר ההפעלה הכרונית של מספר סוגים של קולטנים / צמוד o Gαi כולל D 2 דופאמין וμ קולטני אופיואידים. למרות רגישות Heterologous של AC דווחה לראשונה לפני כארבעה עשורים, המנגנון (ים) העומד בבסיס תופעה זו אינו ידוע ברוב. המחסור בנתונים מכניסטית ככל הנראה משקפים את המורכבות כרוכות בתגובה מסתגלת זה, טוען כי גישות nonbiased יכולים לסייע בזיהויing המסלולים המולקולריים מעורבים ברגישות Heterologous של AC. מחקרים קודמים מעורבים קינאז ואיתות Gbγ כחופפים מרכיבים המווסתים את רגישות Heterologous של AC. כדי לזהות מטרות חופפות וייחודיות נוספות הקשורות לרגישות של AC, הפיתוח והאימות של assay רגישות cAMP מדרגי נדרש לתפוקה גדולה יותר. גישות קודמות כדי ללמוד רגישות הן בדרך כלל מסורבלות מעורבת תחזוקה רציפה תא תרבות, כמו גם במתודולוגיה מורכבת למדידת צבירת cAMP שכוללת שלבי שטיפה מרובים. לכן, הפיתוח של assay מבוסס תאים חזק שיכול לשמש עבור הקרנת תפוקה גבוהה (HTS) בפורמט גם 384 יקל מחקרים עתידיים. שימוש בשני דגמי D 2 קולטן דופמין סלולריים (כלומר. CHO-D 2L וHEK-AC6 / D 2L), יש לנו להמיר assay שלנו 48 היטב הרגישות (> 20 צעדים 4-5 ימים) ולחמש-sTEP, assay יום אחד בפורמט 384 גם. התבנית חדשה זו ניתנת להקרנת מולקולה קטנה, ואנו מראים כי עיצוב assay זה יכול גם לשמש בקלות עבור transfection ההפוך של siRNA בציפייה להקרנת ספריית siRNA ממוקד.
Introduction
Cyclase adenylyl אדפטיבית (AC) איתות תגובה המכונה Heterologous או סופר רגישות התגלה לראשונה במעבדתו של חתן פרס נובל, ד"ר מרשל נירנברג. ד"ר נירנברג הציעה שנצפתה היענות AC עלתה בעקבות הפעלת קולטן כרונית δ אופיואידים הייתה מנגנון המעורב בסובלנות אופיום ותלות 1. בנוסף להפעלת קולטן כרונית δ אופיואידים, תגובת neuroadaptive זה של איתות AC מתרחשת גם לאחר הפעלה מתמשכת של כמה קולטנים אחרים Gαi / מצמידים o 2. יש לציין, רבים של קולטנים אלה קשורים לכאב, הפרעות נוירופסיכיאטריות ונוירולוגיות, וכוללים אופיואידים μ / κ, D דופמין 2/4, 5HT 1A, ו-M 2/4 קולטנים מוסקריניים 2. בנוסף לממצאיו של ד"ר נירנברג, גוף גדול של ראיות המקשר רגישות של איתות AC להפעלת קולט אופיואידים כרונית שני <eמ> במבחנה in vivo 3-7. רגישות של AC גם הייתה קשורה עם מגוון רחב של מחלות מעורבים קולטני דופאמין כמו 2 D כולל סכיזופרניה ומחלת פרקינסון (לסקירה ראתה התייחסות 2). למרות החשיבות הפוטנציאלית של רגישות, המנגנון המדויק (ים) הקשורים / הפעלה מתמשכת Gαi מצמידים o רצפטור שמוביל לעלייה בהיענות AC נשארה במידה רבה לא ידועה.
מחקרים אלה מספקים רציונל לבחינת המנגנונים לרגישות של cyclase adenylyl כיעד הנוירוביולוגי חשוב. כמו כן, את הרלוונטיות הפיזיולוגיות של AC איתות 8 ואת החשיבות שisoforms AC הבודד להחזיק בתגובה מסתגלת זה צריכים גם להיות מוכר 2,9,10. בהקשר של המחקר שלנו, את התכונות הכלליות הקשורים לרגישות Heterologous של isoforms רקומביננטי של AC במקביל מאפיינים אלה described ללימוד isoforms אנדוגני של AC. באופן ספציפי, המחקרים קודמים מצאו כי ההפעלה של חלבוני Gαi / o ויחידות מהשנה שלאחר מכן שחרור / βγ התארגנות הן דרישות חשובות לרגישות הקולטן המושרית של כל isoforms AC. בנוסף, מספר מחקרים מצביעים על כך שהאיתות מקינאז החלבון ויחידות משנת Gβγ מעורבות ברגישות 2,11-13. מזגנים בודדים גם להציג דפוסי רגישות ייחודיים ומובחנים 12. לדוגמא, חשיפה מתמשכת של D 2 קולטנים לאגוניסטים קשורה לרגישות של AC1 וAC8 Ca 2 גירוי + / calmodulin 14,15, ואילו AC3 הקשור קשר הדוק לא רגיש 2. AC2, AC4, וAC7 קשור באופן הדוק, עם זאת, רק פעילות AC2 PKC מגורה היא רגישה וחסונה לאחר חשיפה ממושכת של D 2 קולטנים לאגוניסטים 7,14,16,17. בנוסף, AC5 וAC6 להראות מידה ניכרת של יתר מכירהרגישות ologous לגז וצבירת cAMP מגורה forskolin הבא הפעלה של D 2 קולטנים 14,18-20, אבל נראה שונים בדרישה שלהם לGβγ מקטע-AC קשרי גומלין ש21. למרות שרוב המחקרים של רגישות AC השתמשו קווי מודל תא (לדוגמא תאי HEK293 להביע isoforms AC הבודד), נראה כי ממצאים אלה לתרגם למודלי תא עצביים מקומיים 4,22. לאחרונה, את ההשפעות של מעכבי איזופורם AC סלקטיבית מולקולה קטנות שזוהו בתאי HEK293 להביע isoforms AC יכולות גם להיות מתורגמות למחקרים התנהגותיים in vivo 23.
חוסר מנגנון מולקולרי שזוהה ולרגישות Heterologous כנראה משקף את המורכבות של התגובה המסתגלת, כמו גם מאפייני רגולציה הייחודיים של הפרט AC isoforms 12. להתיר מורכבות כזה מסתבך עוד יותר על ידי השימוש במתודולוגיה לא מסורבליםכובע הגביל חוקרים אקדמיים מהעסקת גישות משוחדת. לדוגמא, המחקרים מכניסטית הקודמים שלנו כללו שימוש במודלים סלולריים ברציפות תרבותי באמצעות 24 – ופורמט תרבית רקמת 48 היטב 15. תאים בתרבית גדלו בדרך כלל עבור 48 שעות ולאחר מכן נתון לטיפול אגוניסט תרופה (2-18 hr) ואחריו סדרה של שוטף התא וincubations (איור 1). פרוטוקולי הצטברות cAMP הספציפי AC-איזופורם היו אז מועסקים ואחרי מדידה של הצטברות cAMP באמצעות [3 H] מפרך וזמן רב cAMP מחייב מתודולוגיה 15,24. המשך מהתחלה ועד סוף לכל assay נדרש בדרך כלל כולל של ארבעה עד חמישה ימים מציפוי תא לניתוח נתונים (איור 1). היישום של טכנולוגיות ואוטומציה חדשות הוביל לשיפורים ניכר ללימודי רגישות בסביבה התעשייתית ומרכז HTS. לדוגמא, קבוצה עובדת עם המרכז הלאומי לחמיםקאל ג'נומיקס דיווח יומיים HTS הליך assay לזיהוי מעכבי מולקולה קטנים של μ רגישות מושרה אופיואידים הקולטן בפורמט 1,536 היטב 25.
המאמר הנוכחי מתאר את המאמצים שלנו כדי לפתח assay HTS ללימודים של רגישות Heterologous תוך שימוש בטכנולוגיות שזמינות ברוב מוסדות מחקר האקדמיים. אסטרטגיה זו הושגה על ידי שילוב של השימוש בתאי cryopreserved ממודלי תא heterologously מבטא את קולטן דופמין D 2 בשילוב עם isoforms cyclase adenylyl רקומביננטי אנדוגני או אדם (CHO-D 2L או HEK-AC6 / D 2 ליטר). כדי לשפר את התפוקה שלנו, אנחנו מחדש assay שלנו 48 גם הרגישות (בערך> 20 צעדים על 4-5 ימים) לחמישה שלבים assay יום אחד, בפורמט 384 גם שהיה למעשה "לערבב ולקרוא". הפורמט החדש משתמש בקרינת זמן הומוגני זמינה מסחרי נפתרה assay (HTRF) כדי למדוד ACC cAMPumulation בתאים שלמים עם קורא צלחת מצב מרובה. Assay הוא איתן וניתן להקרנת מולקולה קטנה, ויכול להיות מיושם בצורה יעילה למסך למעכבים של רגישות Heterologous. בנוסף, אנו מספקים מידע שמאפשר השימוש של assay זה עם transfection ההפוך של siRNA להקרנת ספריית siRNA רחבה ממוקדת או הגנום עם שינוי קל בלבד לגישה הכללית.
Protocol
Representative Results
Discussion
במאמץ להקל על מחקרים של רגישות Heterologous, יש לנו בהרחבה שונו השיטה הקודמת שלנו להשגת יעילה "תערובת ולקרוא" פורמט זה הוא amendable להקרנת תפוקה גבוהה ומנגנון של בדיקת פעולה. השינויים העיקריים לפרוטוקול שלנו ניתן לסכם באופן הבא: 1) השימוש בתאי cryopreserved כמו חומרים כימיים "…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מבקשים להודות למר ריצ'רד אבץ וטוד Wiernicki להכשרה מתודולוגית והדרכה assay. אנו מודים גם יוחנן פאולוס ספנס לקריאה זהירה ועריכת הצעות. עבודה זו נתמכה על ידי המכון הלאומי לבריאות 060,397 MH, מוח והתנהגות קרן מחקר, ואלי לילי וחברה באמצעות התכנית לילי פרס המחקר (LRAP).
Materials
| CHO-K1-DRD2L cells | DiscoveRx | 930579C2 | |
| Ham’s F12 media | VWR | SH30026fs | |
| Fetal Bovine Serum | VWR | SH3007003 | |
| G418 | Sigma | A1720 | |
| Hygromycin | Fisher | 50-230-5556 | |
| Penicillin/ streptomycin | Life Technologies | 15070063 | |
| 15 cm dishes | BD Falcon | 353025 | |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| Cell dissociation buffer | Life Technologies | 13150016 | |
| Phosphate Buffered Saline | Life Technologies | 10010-049 | |
| Cryovials | Fisher | 976171 | |
| Opti-MEM | Life Technologies | 31985070 | |
| TC treated 384 well plates | Perkin-Elmer | 6007688 | |
| HTRF cAMP Dynamic 2 kit | Cisbio Bioassays | 62AM4PEB | http://www.htrf.com/camp-cell-based-assay |
| Synergy 4 | Biotek | H4MLFPTAD | |
| Prism 6 | GraphPad Software | NA | |
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine | Sigma | I5879 | |
| (±)Quinpirole | Sigma | Q111 | |
| Spiperone | Sigma | S7395 | |
| Clozapine | Sigma | C6305 | |
| Haloperidol | Sigma | H1512 | |
| S-(-)Sulpiride | Sigma | S112 | |
| Lipofectamine2000 transfection reagent | Invitrogen | 11668019 | |
| Trypan blue | Life Technologies | T10282 | |
| Water, DNase, RNase-free | MP Biomedicals | 821739 | |
| Gas siRNA | Dharmacon | custom siRNA | |
| Non-targeting siRNA control | Dharmacon | D-001206-14-20 | |
| siGlo Red | Dharmacon | D-001630-02 |
References
- Sharma, S. K., Klee, W. A., Nirenberg, M. Dual regulation of adenylate cyclase accounts for narcotic dependence and tolerance. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 72, 3092-3096 (1975).
- Watts, V. J., Neve, K. A. Sensitization of adenylate cyclase by Galpha(i/o)-coupled receptors. Pharmacol. Ther. 106, 405-421 (2005).
- Christie, M. J. Cellular neuroadaptations to chronic opioids: tolerance, withdrawal and addiction. Br. J. Pharmacol. 154, 384-396 (2008).
- Fan, P., Jiang, Z., Diamond, I., Yao, L. Up-regulation of AGS3 during morphine withdrawal promotes cAMP superactivation via adenylyl cyclase 5 and 7 in rat nucleus accumbens/striatal neurons. Mol. Pharmacol. 76 (3), 526-533 (2009).
- Bohn, L. M., Gainetdinov, R. R., Lin, R. T., Lefkowitz, R. J., Caron, M. G. m-Opioid receptor desensitization by β-arrestin-2 determines morphine tolerance but not dependence. Nature. 408, 720-723 (2000).
- Nestler, E. J. Molecular basis of long-term plasticity underlying addiction. Nat. Rev. 2, 119-128 (2001).
- Avidor-Reiss, T., Nevo, I., Saya, D., Bayewitch, M., Vogel, Z. Opiate-induced adenylyl cyclase superactivation is isozyme-specific. J. Biol. Chem. 272, 5040-5047 (1997).
- Sadana, R., Dessauer, C. W. Physiological roles for G protein-regulated adenylyl cyclase isoforms: insights from knockout and overexpression studies. Neurosignals. 17, 5-22 (2009).
- Kim, K. S., et al. Adenylyl cyclase type 5 (AC5) is an essential mediator of morphine action. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 3908-3913 (2006).
- Watts, V. J. Adenylyl cyclase isoforms as novel therapeutic targets: an exciting example of excitotoxicity neuroprotection. Mol. Interv. 7, 70-73 (2007).
- Beazely, M. A., Watts, V. J. Regulatory properties of adenylate cyclases type 5 and 6: A progress report. Eur. J. Pharmacol. 535, 1-12 (2006).
- Ejendal, K. F. K., Przybyla, J. A., Watts, V. J., Siehler, S., Milligan, G. Chapter 10. Adenylyl cyclase isoform-specific signaling of GPCRs. G Protein-Coupled Receptors: Structure, Signaling, and Physiology. 10, 189-217 (2010).
- Lin, Y., Smrcka, A. V. Understanding molecular recognition by G protein betagamma subunits on the path to pharmacological targeting. Mol. Pharmacol. 80, 551-557 (2011).
- Cumbay, M. G., Watts, V. J. Heterologous sensitization of recombinant adenylate cyclases by activation of D2 dopamine receptors. J. Pharmacol. Exp. Ther. 297, 1201-1209 (2001).
- Watts, V. J., Neve, K. A. Sensitization of endogenous and recombinant adenylate cyclase by activation of D2 dopamine receptors. Mol. Pharmacol. 50, 966-976 (1996).
- Nevo, I., et al. Regulation of adenylyl cyclase isozymes on acute and chronic activation of inhibitory receptors. Mol. Pharmacol. 54, 419-426 (1998).
- Nevo, I., Avidor-Reiss, T., Levy, R., Bayewitch, M., Vogel, Z. Acute and chronic activation of the m-opioid receptor with the endogenous ligand endomorphin differentially regulates adenylyl cyclase isozymes. Neuropharmacology. 39, 364-371 (2000).
- Beazely, M. A., Watts, V. J. Activation of a novel PKC isoform synergistically enhances D2L dopamine receptor-mediated sensitization of adenylate cyclase type 6. Cell. Signal. 17, 647-653 (2005).
- Vortherms, T. A., Nguyen, C. H., Berlot, C. H., Watts, V. J. Using molecular tools to dissect the role of Gs in sensitization of AC1. Mol. Pharmacol. 66, 1617-1624 (2004).
- Watts, V. J., Taussig, R., Neve, R., Neve, K. A. Dopamine D2 receptor-induced heterologous sensitization of adenylyl cyclase requires Gas: Characterization of Gas-insensitive mutants of adenylyl cyclase V. Mol. Pharmacol. 60, 1168-1172 (2001).
- Ejendal, K. F., Dessauer, C. W., Hebert, T. E., Watts, V. J. Dopamine D(2) Receptor-Mediated Heterologous Sensitization of AC5 Requires Signalosome Assembly. J. Signal Transduct. 2012, 210324 (2012).
- Johnston, C. A., Beazely, M. A., Vancura, A. F., Wang, J. K. T., Watts, V. J. Heterologous sensitization of adenylate cyclase is protein kinase A-dependent in Cath.a differentiated (CAD)-D2L cells. J. Neurochem. 82, 1087-1096 (2002).
- Wang, H., et al. Identification of an adenylyl cyclase inhibitor for treating neuropathic and inflammatory pain. Sci. Transl. Med. 3, 65ra3 (2011).
- Nordstedt, C., Fredholm, B. B. A modification of a protein-binding method for rapid quantification of cAMP in cell-culture supernatants and body fluid. Anal. Biochem. 189, 231-234 (1990).
- Xia, M., et al. Inhibition of morphine-induced cAMP overshoot: a cell-based assay model in a high-throughput format. Cell. Mol. Neurobiol. 31, 901-907 (2011).
- Zaman, G. J., de Roos, J. A., Blomenrohr, M., Van Koppen, C. J., Oosterom, J. Cryopreserved cells facilitate cell-based drug discovery. Drug Discov. Today. 12, 521-526 (2007).
- Varga, E. V., et al. Identification of adenylyl cyclase isoenzymes in CHO and B82 cells. Eur. J. Pharmacol. 348, R1-R2 (1998).
- Masri, B., et al. Antagonism of dopamine D2 receptor/beta-arrestin 2 interaction is a common property of clinically effective antipsychotics. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 13656-13661 (2008).
- Thaker, N. G., et al. Functional genomic analysis of glioblastoma multiforme through short interfering RNA screening: a paradigm for therapeutic development. Neurosurg. Focus. 28, E4 (2010).
- Echeverri, C. J., Perrimon, N. High-throughput RNAi screening in cultured cells: a user’s guide. Nat. Rev. Geneti. 7, 373-384 (2006).
- Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. J. Biomol. Screen. 4, 67-73 (1999).
- Ejendal, K. F., et al. Discovery of antagonists of tick dopamine receptors via chemical library screening and comparative pharmacological analyses. Insect Biochem. Mol. Biol. 42, 846-853 (2012).
- Meyer, J. M., et al. A “genome-to-lead” approach for insecticide discovery: pharmacological characterization and screening of Aedes aegypti D(1)-like dopamine receptors. PLoS Negl.Trop. Dis. 6, e1478 (2012).
- Thorne, N., Inglese, J., Auld, D. S. Illuminating insights into firefly luciferase and other bioluminescent reporters used in chemical biology. Chem. Biol. 17, 646-657 (2010).
- Fan, F., et al. Novel genetically encoded biosensors using firefly luciferase. ACS Chem. Biol. 3, 346-351 (2008).
- Jiang, L. I., et al. Use of a cAMP BRET sensor to characterize a novel regulation of cAMP by the sphingosine 1-phosphate/G13 pathway. J. Biol. Chem. 282, 10576-10584 (2007).
