Induzida por drogas Sensibilização de adenililciclase: Racionalização Ensaio e miniaturização para pequenas moléculas e siRNA Triagem Applications
Summary
Ativação persistente de inibição G receptores acoplados à proteína resulta em sensibilização da adenilil ciclase sinalização. Para identificar as vias moleculares essenciais, abordagens nonbiased são necessárias, no entanto, esta estratégia requer o desenvolvimento de um ensaio escalável sensibilização AMPc baseado em células. Relata-se um ensaio de sensibilização para a pequena molécula e triagem siRNA.
Abstract
Sensibilização de adenilil-ciclase (AC) de sinalização tem sido implicada numa variedade de distúrbios neuropsiquiátricos e neurológicas, incluindo o abuso de substâncias e na doença de Parkinson. Activação aguda de Gαi / O-ligada receptores inibe a actividade de AC, enquanto que a activação persistente de estes receptores resulta na sensibilização heteróloga de CA e um aumento dos níveis de AMPc intracelular. Estudos anteriores demonstraram que esta melhoria da capacidade de resposta de CA é observada tanto in vitro e in vivo a seguir a activação crónica de vários tipos de receptores Gαi / ligada a O, incluindo D 2 da dopamina e μ receptores opióides. Apesar de sensibilização heteróloga do AC foi relatada pela primeira vez há quatro décadas, o mecanismo (s) que estão na base deste fenômeno são ainda desconhecidas. A falta de dados mecanicistas presumivelmente reflete a complexidade envolvida com esta resposta adaptativa, o que sugere que as abordagens nonbiased poderia ajudar na identificaçãoção das vias moleculares envolvidas na sensibilização heteróloga do AC. Estudos anteriores têm implicado quinase e sinalização Gbγ como sobreposição de componentes que regulam a sensibilização heteróloga do AC. Para identificar alvos sobrepostos únicos e adicionais associados com a sensibilização da AC, o desenvolvimento ea validação de um ensaio de sensibilização cAMP escalável é necessário para uma maior taxa de transferência. As abordagens anteriores para estudar sensibilização são geralmente complicado que implica a manutenção de cultura de células contínuo, bem como uma complexa metodologia para medição da acumulação de AMPc que envolve vários passos de lavagem. Assim, o desenvolvimento de um ensaio de base celular robusto, que pode ser utilizado para rastreio de alto rendimento (HTS) em um formato de 384 poços iria facilitar estudos futuros. Usando dois modelos celulares D 2 receptores de dopamina (ie. CHO-D 2D e HEK-AC6 / D 2D), convertemos o nosso ensaio de sensibilização 48 poços (> 20 passos 4-5 dias) para um período de cinco step, ensaio dia único em formato de 384 poços. Este novo formato é passível de triagem pequena molécula, e que demonstram que este desenho do ensaio também pode ser facilmente utilizado para a transfecção reversa de siRNA em antecipação de rastreio da biblioteca de siRNA alvo.
Introduction
Um adenililciclase adaptativo (AC) de sinalização de resposta conhecida como a sensibilização de super-heteróloga ou foi descoberto pela primeira vez no laboratório do Prêmio Nobel, Dr. Marshall Nirenberg. Dr. Nirenberg proposto que o aumento da capacidade de resposta AC observado após a ativação do receptor opióide δ crônica era um mecanismo envolvido na tolerância e dependência de opiáceos 1. Além disso a activação do receptor opióide δ crónica, esta resposta neuroadaptativo de sinalização AC também ocorre a seguir a activação persistente de vários outros Gαi / acoplada-o-receptores 2. Notavelmente, muitos destes receptores estão associados com a dor, distúrbios neuropsiquiátricos e neurológicas, e incluem opióide μ / κ, D 2/4 da dopamina, 5HT 1A, e M 2/4 receptores muscarínicos 2. Além de descobertas do Dr. Nirenberg, um grande corpo de evidências que liguem sensibilização de sinalização AC para a ativação do receptor opióide crônica tanto <em> in vitro e in vivo 3-7. Sensibilização de CA também tem sido associado com uma variedade de doenças que envolvem receptores de dopamina D-2, como incluindo esquizofrenia e da doença de Parkinson (para revisão ver referência 2). Apesar da importância potencial de sensibilização, o mecanismo preciso (s) associado com a ativação persistente Gαi / acoplada-o receptor que leva ao aumento da capacidade de resposta AC permanece em grande parte desconhecido.
Estes estudos fornecem a justificativa para examinar os mecanismos de sensibilização dos adenililciclase como um importante alvo neurobiológica. Da mesma forma, a relevância fisiológica da AC sinalização 8 e a importância que as isoformas individuais de corrente alternada conter nesta resposta adaptativa também deve ser reconhecido 2,9,10. No contexto de nossa pesquisa, as características gerais associadas com a sensibilização heteróloga das isoformas recombinantes de AC paralelo essas características descrita para estudar as isoformas endógenos de AC. Especificamente, pesquisas anteriores descobriram que a ativação de proteínas Gαi / o e subunidades posterior liberação / βγ rearranjo são requisitos importantes para a sensibilização do receptor induzida de todas as isoformas de AC. Além disso, diversos estudos sugerem que a sinalização de proteina-quinases e subunidades Gβγ esteja envolvido na sensibilização 2,11-13. ACs individuais também exibir padrões de sensibilização únicas e distintas 12. Por exemplo, a exposição persistente de receptores D 2 de agonistas está relacionado com a sensibilização de AC1 e AC8 em Ca 2 + / calmodulina 14,15 estimulação, ao passo que a AC3 estreitamente relacionada não é sensibilizado 2. AC2, AC4, e AC7 estão intimamente relacionados, no entanto, apenas a actividade da PKC-AC2 é estimulado de forma robusta sensibilizadas depois de exposição prolongada de receptores D 2 de agonistas 7,14,16,17. Além disso, AC5 e AC6 mostram um acentuado grau de hetersensibilização para ologous e Gás-acumulação de AMPc estimulada por forskolin após a ativação de receptores D 2 14,18-20, mas parecem diferir em sua exigência para Gβγ subunidade-AC interações 21. Embora a maioria dos estudos de sensibilização AC usaram linhagens de células modelo (por exemplo, células HEK293 expressando isoformas AC individuais), parece que estes resultados traduzem-se em modelos de células neuronais nativos 4,22. Mais recentemente, os efeitos de inibidores selectivos de pequenas molécula de isoformas AC identificados em células HEK293 que expressam as isoformas AC também podem ser convertidos para os estudos in vivo do comportamento 23.
A falta de um mecanismo molecular para a identificação de sensibilização heterólogo provavelmente reflecte a complexidade da resposta adaptativa, bem como as propriedades reguladoras únicas do indivíduo AC isoformas 12. Desvendando tal complexidade é ainda mais complicada pelo uso de metodologia pesado tchapéu limitou investigadores académicos de empregar abordagens imparcial. Por exemplo, os nossos estudos mecanísticos envolveu o uso de modelos celulares continuamente cultivadas utilizando 24 – e 48-formato de poço de cultura de tecidos de 15. As células em cultura foram normalmente cultivadas durante 48 horas e, em seguida, submetido a tratamento com drogas agonistas (2-18 horas), seguido por uma série de lavagens e incubações de células (Figura 1). AC-isoforma específica de cAMP de acumulação protocolos foram então empregues, seguido por medição da acumulação de cAMP utilizando um processo trabalhoso e demorado [3 H] metodologia 15,24 ligação cAMP. A duração do início ao fim, para cada ensaio, geralmente requerido um total de quatro a cinco dias de plaqueamento de células para análise de dados (Figura 1). A aplicação de novas tecnologias e automação tem levado a melhorias marcado para estudos de sensibilização no ambiente industrial e HTS centro. Por exemplo, um grupo de trabalho com o Centro Nacional de Chemical Genomics relatou um dia dois HTS processo de ensaio para identificar pequenas moléculas inibidoras da μ do receptor opióide sensibilização induzida no formato 1536-25 bem.
O presente artigo descreve os nossos esforços para desenvolver um ensaio HTS para estudos de sensibilização heteróloga utilizando tecnologias que estão disponíveis na maioria das instituições de pesquisa acadêmica. Esta estratégia foi conseguida por incorporação do uso de células criopreservadas de modelos celulares expressando heterologamente o receptor de dopamina D 2 em combinação com as isoformas de adenilil-ciclase recombinante endógenos ou individuais (CHO-D 2L ou células HEK-AC6 / D 2 L). Para melhorar o nosso rendimento, redesenhamos nosso ensaio de sensibilização 48 bem (cerca de> 20 passos mais 4-5 dias) para um de cinco etapas, ensaio dia único em formato de 384 poços que era essencialmente "misturar e ler". O novo formato utiliza um tempo homogêneo de fluorescência resolvida disponível comercialmente (HTRF) ensaio para medir cAMP accumulation em células intactas com um leitor de placa de multi modo. O ensaio é robusto e passíveis de triagem pequena molécula, e pode ser efectivamente aplicado a triagem de inibidores de sensibilização heteróloga. Além disso, podemos fornecer dados que permitem o uso deste ensaio com transfecção reversa de siRNA para triagem ampla biblioteca siRNA alvo ou genoma, com apenas uma pequena modificação para a abordagem geral.
Protocol
Representative Results
Discussion
Em um esforço para facilitar os estudos de sensibilização heteróloga, temos extensivamente modificado nosso método anterior alcançar uma simplificada "mix e ler" formato que pode ser alterada a seleção de alto rendimento e mecanismo de exame ação. As modificações importantes nosso protocolo pode ser resumido como se segue: 1) o uso de células criopreservadas como reagentes de ensaio "pronto", 2) a miniaturização do ensaio em formato de 384 poços, e 3) a utilização da medição de HT…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores gostariam de agradecer o Sr. Richard Zink e Todd Wiernicki para treinamento e orientação metodológica ensaio. Agradecemos também a John Paul Spence para a leitura cuidadosa e sugestões editoriais. Este trabalho foi financiado pelo Instituto Nacional de Saúde MH 060397, Brain and Behavior Research Foundation, e Eli Lilly and Company por meio do Programa de Pesquisa Prêmio Lilly (LRAP).
Materials
| CHO-K1-DRD2L cells | DiscoveRx | 930579C2 | |
| Ham’s F12 media | VWR | SH30026fs | |
| Fetal Bovine Serum | VWR | SH3007003 | |
| G418 | Sigma | A1720 | |
| Hygromycin | Fisher | 50-230-5556 | |
| Penicillin/ streptomycin | Life Technologies | 15070063 | |
| 15 cm dishes | BD Falcon | 353025 | |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| Cell dissociation buffer | Life Technologies | 13150016 | |
| Phosphate Buffered Saline | Life Technologies | 10010-049 | |
| Cryovials | Fisher | 976171 | |
| Opti-MEM | Life Technologies | 31985070 | |
| TC treated 384 well plates | Perkin-Elmer | 6007688 | |
| HTRF cAMP Dynamic 2 kit | Cisbio Bioassays | 62AM4PEB | http://www.htrf.com/camp-cell-based-assay |
| Synergy 4 | Biotek | H4MLFPTAD | |
| Prism 6 | GraphPad Software | NA | |
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine | Sigma | I5879 | |
| (±)Quinpirole | Sigma | Q111 | |
| Spiperone | Sigma | S7395 | |
| Clozapine | Sigma | C6305 | |
| Haloperidol | Sigma | H1512 | |
| S-(-)Sulpiride | Sigma | S112 | |
| Lipofectamine2000 transfection reagent | Invitrogen | 11668019 | |
| Trypan blue | Life Technologies | T10282 | |
| Water, DNase, RNase-free | MP Biomedicals | 821739 | |
| Gas siRNA | Dharmacon | custom siRNA | |
| Non-targeting siRNA control | Dharmacon | D-001206-14-20 | |
| siGlo Red | Dharmacon | D-001630-02 |
References
- Sharma, S. K., Klee, W. A., Nirenberg, M. Dual regulation of adenylate cyclase accounts for narcotic dependence and tolerance. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 72, 3092-3096 (1975).
- Watts, V. J., Neve, K. A. Sensitization of adenylate cyclase by Galpha(i/o)-coupled receptors. Pharmacol. Ther. 106, 405-421 (2005).
- Christie, M. J. Cellular neuroadaptations to chronic opioids: tolerance, withdrawal and addiction. Br. J. Pharmacol. 154, 384-396 (2008).
- Fan, P., Jiang, Z., Diamond, I., Yao, L. Up-regulation of AGS3 during morphine withdrawal promotes cAMP superactivation via adenylyl cyclase 5 and 7 in rat nucleus accumbens/striatal neurons. Mol. Pharmacol. 76 (3), 526-533 (2009).
- Bohn, L. M., Gainetdinov, R. R., Lin, R. T., Lefkowitz, R. J., Caron, M. G. m-Opioid receptor desensitization by β-arrestin-2 determines morphine tolerance but not dependence. Nature. 408, 720-723 (2000).
- Nestler, E. J. Molecular basis of long-term plasticity underlying addiction. Nat. Rev. 2, 119-128 (2001).
- Avidor-Reiss, T., Nevo, I., Saya, D., Bayewitch, M., Vogel, Z. Opiate-induced adenylyl cyclase superactivation is isozyme-specific. J. Biol. Chem. 272, 5040-5047 (1997).
- Sadana, R., Dessauer, C. W. Physiological roles for G protein-regulated adenylyl cyclase isoforms: insights from knockout and overexpression studies. Neurosignals. 17, 5-22 (2009).
- Kim, K. S., et al. Adenylyl cyclase type 5 (AC5) is an essential mediator of morphine action. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 3908-3913 (2006).
- Watts, V. J. Adenylyl cyclase isoforms as novel therapeutic targets: an exciting example of excitotoxicity neuroprotection. Mol. Interv. 7, 70-73 (2007).
- Beazely, M. A., Watts, V. J. Regulatory properties of adenylate cyclases type 5 and 6: A progress report. Eur. J. Pharmacol. 535, 1-12 (2006).
- Ejendal, K. F. K., Przybyla, J. A., Watts, V. J., Siehler, S., Milligan, G. Chapter 10. Adenylyl cyclase isoform-specific signaling of GPCRs. G Protein-Coupled Receptors: Structure, Signaling, and Physiology. 10, 189-217 (2010).
- Lin, Y., Smrcka, A. V. Understanding molecular recognition by G protein betagamma subunits on the path to pharmacological targeting. Mol. Pharmacol. 80, 551-557 (2011).
- Cumbay, M. G., Watts, V. J. Heterologous sensitization of recombinant adenylate cyclases by activation of D2 dopamine receptors. J. Pharmacol. Exp. Ther. 297, 1201-1209 (2001).
- Watts, V. J., Neve, K. A. Sensitization of endogenous and recombinant adenylate cyclase by activation of D2 dopamine receptors. Mol. Pharmacol. 50, 966-976 (1996).
- Nevo, I., et al. Regulation of adenylyl cyclase isozymes on acute and chronic activation of inhibitory receptors. Mol. Pharmacol. 54, 419-426 (1998).
- Nevo, I., Avidor-Reiss, T., Levy, R., Bayewitch, M., Vogel, Z. Acute and chronic activation of the m-opioid receptor with the endogenous ligand endomorphin differentially regulates adenylyl cyclase isozymes. Neuropharmacology. 39, 364-371 (2000).
- Beazely, M. A., Watts, V. J. Activation of a novel PKC isoform synergistically enhances D2L dopamine receptor-mediated sensitization of adenylate cyclase type 6. Cell. Signal. 17, 647-653 (2005).
- Vortherms, T. A., Nguyen, C. H., Berlot, C. H., Watts, V. J. Using molecular tools to dissect the role of Gs in sensitization of AC1. Mol. Pharmacol. 66, 1617-1624 (2004).
- Watts, V. J., Taussig, R., Neve, R., Neve, K. A. Dopamine D2 receptor-induced heterologous sensitization of adenylyl cyclase requires Gas: Characterization of Gas-insensitive mutants of adenylyl cyclase V. Mol. Pharmacol. 60, 1168-1172 (2001).
- Ejendal, K. F., Dessauer, C. W., Hebert, T. E., Watts, V. J. Dopamine D(2) Receptor-Mediated Heterologous Sensitization of AC5 Requires Signalosome Assembly. J. Signal Transduct. 2012, 210324 (2012).
- Johnston, C. A., Beazely, M. A., Vancura, A. F., Wang, J. K. T., Watts, V. J. Heterologous sensitization of adenylate cyclase is protein kinase A-dependent in Cath.a differentiated (CAD)-D2L cells. J. Neurochem. 82, 1087-1096 (2002).
- Wang, H., et al. Identification of an adenylyl cyclase inhibitor for treating neuropathic and inflammatory pain. Sci. Transl. Med. 3, 65ra3 (2011).
- Nordstedt, C., Fredholm, B. B. A modification of a protein-binding method for rapid quantification of cAMP in cell-culture supernatants and body fluid. Anal. Biochem. 189, 231-234 (1990).
- Xia, M., et al. Inhibition of morphine-induced cAMP overshoot: a cell-based assay model in a high-throughput format. Cell. Mol. Neurobiol. 31, 901-907 (2011).
- Zaman, G. J., de Roos, J. A., Blomenrohr, M., Van Koppen, C. J., Oosterom, J. Cryopreserved cells facilitate cell-based drug discovery. Drug Discov. Today. 12, 521-526 (2007).
- Varga, E. V., et al. Identification of adenylyl cyclase isoenzymes in CHO and B82 cells. Eur. J. Pharmacol. 348, R1-R2 (1998).
- Masri, B., et al. Antagonism of dopamine D2 receptor/beta-arrestin 2 interaction is a common property of clinically effective antipsychotics. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 13656-13661 (2008).
- Thaker, N. G., et al. Functional genomic analysis of glioblastoma multiforme through short interfering RNA screening: a paradigm for therapeutic development. Neurosurg. Focus. 28, E4 (2010).
- Echeverri, C. J., Perrimon, N. High-throughput RNAi screening in cultured cells: a user’s guide. Nat. Rev. Geneti. 7, 373-384 (2006).
- Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. J. Biomol. Screen. 4, 67-73 (1999).
- Ejendal, K. F., et al. Discovery of antagonists of tick dopamine receptors via chemical library screening and comparative pharmacological analyses. Insect Biochem. Mol. Biol. 42, 846-853 (2012).
- Meyer, J. M., et al. A “genome-to-lead” approach for insecticide discovery: pharmacological characterization and screening of Aedes aegypti D(1)-like dopamine receptors. PLoS Negl.Trop. Dis. 6, e1478 (2012).
- Thorne, N., Inglese, J., Auld, D. S. Illuminating insights into firefly luciferase and other bioluminescent reporters used in chemical biology. Chem. Biol. 17, 646-657 (2010).
- Fan, F., et al. Novel genetically encoded biosensors using firefly luciferase. ACS Chem. Biol. 3, 346-351 (2008).
- Jiang, L. I., et al. Use of a cAMP BRET sensor to characterize a novel regulation of cAMP by the sphingosine 1-phosphate/G13 pathway. J. Biol. Chem. 282, 10576-10584 (2007).
