Ihållande aktivering av hämmande G-proteinkopplade receptorerna ger sensibilisering av adenylylcyklas signalering. För att identifiera de grundläggande molekylära vägar, nonbiased metoder är nödvändiga, men kräver denna strategi att utveckla en skalbar cellbaserade cAMP allergi analys. Häri beskriver vi en allergi test för små molekyler och siRNA screening.
Sensibilisering av adenylylcyklas (AC)-signalering har varit inblandad i en mängd olika neuropsykiatriska och neurologiska störningar inklusive drogmissbruk och Parkinsons sjukdom. Akut aktivering av Gαi / o-kopplade receptorer hämmar AC-aktivitet, medan ihållande aktivering av dessa receptorerna ger heterologa sensibilisering av AC och ökade nivåer av intracellulär cAMP. Tidigare studier har visat att denna ökning av AC respons observeras både in vitro och in vivo efter den kroniska aktiveringen av ett antal olika Gαi / O-kopplade receptorer, inklusive D-2 dopamin och μ-opioidreceptorer. Även heterologa sensibilisering av AC rapporterades först fyra decennier sedan, den mekanism (er) som ligger bakom detta fenomen i stort sett okända. Bristen på mekanistiska data förmodligen speglar komplexiteten med detta adaptiv respons, vilket tyder på att nonbiased tillvägagångssätt skulle kunna hjälpa till att identifieraning de molekylära vägar som är involverade i heterologa sensibilisering av AC. Tidigare studier har blandat in kinas och Gbγ signalering som överlappande komponenter som reglerar heterologa sensibilisering av AC. För att identifiera unika och ytterligare överlappande mål i samband med allergi av AC, krävs för ökad genomströmning utveckling och validering av en skalbar cAMP sensibilisering analys. Tidigare metoder för att studera sensibilisering generellt besvärliga involverar kontinuerlig cellodling underhåll samt en komplicerad metod för att mäta cAMP ackumulation som involverar flera tvättsteg. Därmed skulle utvecklingen av en robust cellbaserad analys som kan användas för high throughput screening (HTS) i en 384 bra format lätta framtida studier. Med hjälp av två D 2 dopaminreceptorcellmodeller (dvs.. CHO-D 2L och HEK-AC6 / D 2L), har vi konverterade våra 48-väl sensibilisering analysen (> 20 steg 4-5 dagar) till en fem-step, enda dag analys i 384-brunnsformat. Det nya formatet är mottaglig för små molekyler screening, och vi visar att denna analys design också lätt kan användas för omvänd transfektion av siRNA i väntan på riktade siRNA biblioteksscreening.
En adaptiv adenylylcyklas (AC) signalering svar kallas heterologa-eller super-sensibilisering upptäcktes först i laboratorium av nobelpristagaren Dr Marshall Nirenberg. Dr Nirenberg föreslog att den observerade ökningen AC lyhördhet efter kronisk δ opioid receptoraktivering var en mekanism involverad i opiat tolerans och beroende 1. Förutom kronisk δ opioid receptoraktivering sker detta neuroadaptive svar av AC-signalering även efter ihållande aktivering av flera andra Gαi / o-kopplade receptorer 2. Noterbart är att många av dessa receptorer är förknippad med smärta, neuro-psykiatriska och neurologiska störningar och innefattar μ / κ opioid, D 2/4 dopamin, 5HT-1A, och M 2/4 muskarinreceptorer 2. Förutom Dr Nirenberg rön, existerar en stor mängd bevis länka sensibilisering av AC-signalering till kronisk opioid receptoraktivering både <em> in vitro och in vivo 3-7. Sensibilisering av AC har också förknippats med en rad olika sjukdomar som involverar D 2-liknande dopaminreceptorer inklusive schizofreni och Parkinsons sjukdom (för översikt se referens 2). Trots den potentiella betydelsen av sensibilisering, den exakta mekanismen (s) i samband med ihållande Gαi / o-kopplad receptor aktivering som leder till ökad AC lyhördhet är i stort sett okända.
Dessa studier ger den logiska grunden för att undersöka mekanismerna för sensibilisering av adenylylcyklas som en viktig neurobiologisk mål. Likaså bör den fysiologiska betydelsen av AC signalering 8 och den vikt som de enskilda AC isoformer håller i detta adaptiv respons också erkännas 2,9,10. Inom ramen för vår forskning, de generella funktioner i samband med heterologa sensibilisering av de rekombinanta isoformer av AC parallellt dessa egenskaper desfaktorer beskrivs för att studera de endogena isoformer av AC. Specifikt har tidigare forskning funnit att aktiveringen av Gαi / o proteiner och efterföljande release / polyadditionsprodukter βγ subenheter är viktiga krav för receptor inducerad sensibilisering av alla AC-isoformer. Dessutom har flera studier tyder på att signalering från proteinkinaser och Gβγ subenheter är involverade i sensibilisering 2,11-13. Individuella AOC visar också unika och distinkta sensibilisering mönster 12. Till exempel är ihärdig exponering av D2-receptorer till agonister associerad med sensibilisering av AC1 och AC8 till Ca 2 + / kalmodulin stimulering 14,15, medan den närbesläktade AC3 inte sensibiliseras två. AC2, AC4, och AC7 är nära besläktade, dock endast PKC-stimulerad AC2 aktivitet robust sensibiliserade efter långvarig exponering av D2-receptorer att agonister 7,14,16,17. Dessutom AC5 och AC6 visar en markant grad av Fastigheterologous sensibilisering för gas och forskolin-stimulerad cAMP-ackumulering efter aktivering av D-2-receptorer 14,18-20, men tycks skilja sig åt i deras krav för Gβγ subenhet-AC interaktioner 21. Även om de flesta studier av AC sensibilisering har använt modellen cellinjer (t.ex. HEK293 celler som uttrycker individuella AC isoformer), verkar det som om dessa resultat innebär att infödda neuronala cellmodeller 4,22. På senare tid, kan effekterna av AC isoform selektiva småmolekylinhibitorer identifierats i HEK293 celler som uttrycker AC isoformer också översättas till in vivo beteendestudier 23.
Avsaknaden av ett identifierat molekylära mekanismen för heterologt sensibilisering sannolikt speglar komplexiteten i den adaptiva svar samt de unika reglerande egenskaperna hos enskilda AC isoformer 12. Reda sådan komplexitet kompliceras ytterligare av att använda besvärliga metod thatt har begränsade akademiska forskare från att använda objektiva metoder. Till exempel våra tidigare mekanistiska studier involverade användning av kontinuerligt odlade cell-modeller med hjälp av 24 – och 48-och vävnadsodling format 15. Odlade celler typiskt odlas under 48 timmar och utsattes sedan för agonist läkemedelsbehandling (2-18 h) följt av en serie av cell tvättar och inkubationer (figur 1). AC-isoformen specifik cAMP-ackumulering protokoll användes sedan följt av mätning av cAMP-ackumulation med användning av en mödosam och tidskrävande [3H] cAMP-bindande metod 15,24. Längden från början till slut för varje analys som krävs i allmänhet sammanlagt fyra till fem dagar från cell bordläggningen till dataanalys (Figur 1). Tillämpningen av ny teknik och automatisering har lett till markanta förbättringar för sensibiliseringsstudier inom industri-och HTS center inställning. Till exempel, en grupp som arbetar med National Center for Chemical Genomics anmälde en två dagars HTS analysförfarande för att identifiera småmolekylära hämmare av μ opioid receptor inducerad sensibilisering i 1536 brunnar 25.
Denna artikel beskriver vårt arbete med att utveckla en HTS-analys för studier av heterolog sensibilisering som använder tekniker som finns tillgängliga på de flesta akademiska forskningsinstitutioner. Strategin genomfördes genom att införliva användningen av frysförvarade celler från cellmodeller heterologt uttrycker D2 dopaminreceptorn i kombination med endogena eller enskilda rekombinanta adenylylcyklas isoformer (CHO-D 2L eller HEK-AC6 / D 2 L). För att förbättra vår kapacitet, omgjorda vi vår 48 väl sensibilisering analys (ca> 20 steg mer än 4-5 dagar) till ett fem steg, dag-analysen i 384 brunnar som var i huvudsak "blanda och läsa". Det nya formatet använder en kommersiellt tillgänglig homogen tidsupplöst fluorescens (HTRF) analys för att mäta cAMP accumulation i intakta celler med en multi mode plattläsare. Analysen är robust och kan bli föremål för liten molekyl screening, och kan effektivt tillämpas för att screena för hämmare av heterolog sensibilisering. Dessutom ger vi information som tillåter användandet av denna analys med omvänd transfektion av siRNA för riktade eller genomet bred siRNA biblioteksscreening med endast en mindre ändring av den allmänna riktlinjen.
I ett försök att underlätta studier av heterolog sensibilisering, har vi omfattande modifierat vår tidigare metod som ger en strömlinjeformad "mix och läsa" format som kan ändras för high-throughput screening och verkningsmekanism undersökning. De stora modifieringar våra protokoll kan sammanfattas enligt följande: 1) användning av frysförvarade celler som "analys-klar" reagenser, 2) att miniatyrisering av analysen i 384 brunnar, och 3) utnyttjandet av HTRF mätning av cAMP.
<p class…The authors have nothing to disclose.
Författarna vill tacka för Richard Zink och Todd Wiernicki för metodutbildning och analys vägledning. Vi tackar också John Paul Spence för noggrann läsning och redaktionella förslag. Detta arbete stöddes av National Institute of Health MH 060.397, Brain and Behavior Research Foundation, och Eli Lilly and Company genom Lilly Research Award Program (LRAP).
CHO-K1-DRD2L cells | DiscoveRx | 930579C2 | |
Ham’s F12 media | VWR | SH30026fs | |
Fetal Bovine Serum | VWR | SH3007003 | |
G418 | Sigma | A1720 | |
Hygromycin | Fisher | 50-230-5556 | |
Penicillin/ streptomycin | Life Technologies | 15070063 | |
15 cm dishes | BD Falcon | 353025 | |
DMSO | Sigma | D2650 | |
Cell dissociation buffer | Life Technologies | 13150016 | |
Phosphate Buffered Saline | Life Technologies | 10010-049 | |
Cryovials | Fisher | 976171 | |
Opti-MEM | Life Technologies | 31985070 | |
TC treated 384 well plates | Perkin-Elmer | 6007688 | |
HTRF cAMP Dynamic 2 kit | Cisbio Bioassays | 62AM4PEB | http://www.htrf.com/camp-cell-based-assay |
Synergy 4 | Biotek | H4MLFPTAD | |
Prism 6 | GraphPad Software | NA | |
3-Isobutyl-1-methylxanthine | Sigma | I5879 | |
(±)Quinpirole | Sigma | Q111 | |
Spiperone | Sigma | S7395 | |
Clozapine | Sigma | C6305 | |
Haloperidol | Sigma | H1512 | |
S-(-)Sulpiride | Sigma | S112 | |
Lipofectamine2000 transfection reagent | Invitrogen | 11668019 | |
Trypan blue | Life Technologies | T10282 | |
Water, DNase, RNase-free | MP Biomedicals | 821739 | |
Gas siRNA | Dharmacon | custom siRNA | |
Non-targeting siRNA control | Dharmacon | D-001206-14-20 | |
siGlo Red | Dharmacon | D-001630-02 |