耐药性检测为HIV-1感染的个体没有抗逆转录病毒疗法(ART)可以指导今后的治疗,提高治疗效果。在艾滋病高流行,但资源有限的环境优化个人和人群健康状况最终将需要负担得起的和可获得的耐药基因分型和解释方法。
HIV-1耐药性有可能会严重危及抗逆转录病毒疗法(ART)的有效性和影响。在撒哈拉以南非洲艺术活动继续扩大,对艺术的个人应密切关注耐药性的出现监控。传播耐药性跟踪病毒株,以艺术已经耐药的传播监测也很关键。不幸的是,耐药性测试仍然没有在资源有限的设置容易获得,因为基因分型是昂贵的,需要先进的实验室和数据管理基础设施。开放获取基因型耐药性的监测方法来管理个人和评估传播耐药性描述。该方法使用药物的耐药模式的解释和个别病人报告的生成免费的开源软件。基因分型协议具有大于95%的用于与AV血浆样品的扩增率iral负荷> 1,000 HIV-1 RNA拷贝/毫升。敏感度显著的病毒载量<1,000 HIV-1 RNA拷贝/毫升下降。这里描述的方法验证对测试经美国食品和药物管理局(FDA)的Viroseq基因分型方法的HIV-1耐药性的方法。这里描述的方法的局限性包括的事实,它不是自动的,并且它也未能扩增来自样品的验证面板的循环重组形式CRF02_AG,虽然它扩增亚型A和B在相同的面板。
艾滋病疫情在南部非洲已迅速发展1与抗逆转录病毒疗法(ART)的个人伴随指数增长,尤其是在南非的2,3。作为大型的治疗方案在降低发病率4,增加在资源有限的环境预期寿命(RLS)5流行病学影响的证据不断积累,努力提高技术覆盖面将愈演愈烈。指引对检测和治疗方案下使用的治疗作为预防工具6,7的演变意味着在处理个人的绝对数量将进一步增加。大量个人的将是艺术的更长的时间作为艺术个体的平均寿命接近,艾滋病毒感染人群8。艾滋病病毒耐药性的发展和传播具有ALWAYS被认为是艺术9-12所取得的成就构成了威胁。因此,有必要更严格监视和监测药物抗性作为多的人正在发起到ART。
基因型耐药性检测(GRT)已成功地应用在发达国家,无论是监视,以及在接受ART个人监测的HIV-1耐药性。在这些情况下,GRT已经融入护理对HIV-1感染者的统一体。大多数国际指南推荐GRT成人或儿童患者未能艺术(一线和二线)13-15,儿童患者暴露预防母亲向婴儿传播(PMTCT)方案,但后来感染16,并在与设置高级别之间急性感染者13-15传播耐药性。然而,成本,技术和基础设施的要求也限制了implementation的类似的方法在RLS的耐药性监测。
南非艾滋病毒治疗和监测指南不建议目前在艺术指导选择使用GRT的个人失败的一线药物17。个人主要基于病毒学(HIV-1 RNA病毒负载)参数切换。然而,在2012年,南部非洲艾滋病临床医师学会出版了第一本南部非洲抗逆转录病毒药物耐药性检测的准则18。这些指南推荐所有成人未能一线和二线抗逆转录和感染的婴儿和儿童接触到预防艾滋病母婴传播18 GRT测试。然而,GRT不建议用于18急性感染的个体,因为没有证据显示目前在南部非洲19-29高水平的传播耐药性。预计其中一些建议将被整合随着时间的推移进入全国特雷各个国家在该地区的atment和监控指引。目前,在2013年南非治疗指南,现在有GRT的在成人二线故障时间,并在为儿童30一线或二线PI为基础的治疗失败时间的建议。
它已经表明,整合GRT到南非治疗指南的话会有潜在的成本无关。考虑到第二线疗法的药物相对比一线药物更加昂贵的成本,使用粒度,以确定病人谁真正需要切换到第二线治疗不会造成任何额外费用给程序。此外,GRT还可以找出其他原因失效,节约治疗方案,并产生对新兴的耐药模式31的信息。因此,有必要减少甚至进一步,以提高访问,护理的质量耐药性监测方法的成本ð结果。
在这里,我们提出了一个GRT方法设计为使用泛型(开放源码)引物进行反转录聚合酶链反应(PCR)和测序( 表1),以及用于耐药性的解释大多是开源软件。临床管理,该协议是由一个全面的检讨和报告的方法与实验耐药性报告,严格遵循国家治疗指南的专家解释称赞。该协议被分成四个不同的部件:1)HIV核糖核酸(RNA)提取,2)反转录聚合酶链反应(PCR)扩增的病毒目标,3)测序和4)的生物信息学方法,色谱图中,对应的分析,策展和序列数据的解释。
几个低成本的内部方法已经在努力,力图使艾滋病病毒耐药性基因分型更实惠33,34,36被描述。有需要对药物的抗药性测试融入护理的连续性就抗逆转录病毒疗法在资源有限的环境个人毫无疑问的。然而,大多数报道的方法集中于药物抗性基因分型中的耐药性在群体水平的监视应用程序。土星/ Life Technologies公司的基因分型方法是监测和耐药性监测一个完全集成的协议。这种方法被设计成一个负担得起的协议落实耐药性,为临床管理报告和生成的解释大多是开源和开放获取生物信息资源。
它是通过与FDA批准的Viroseq基因分型方法是比较示在确定由ANRS能力验证样品的面板,在面板的实验室样品已成功扩增100%耐药突变准确。精度也评估对C亚型病毒,在南部非洲最主要的亚型的临床标本。该方法是准确的C亚型的样品,因为它是对亚型A和B,但是,如果该方法将在世界上CRF02_AG是普遍存在的其它部分中使用,有必要对引物,因为该方法的修改未能扩增被证明具有CRF02_AG面板样品之一。可替换地,简并引物组对所有M组病毒33敏感,36可以使用在区域,进行亚型分布更加异构38。
反转录和PCR的灵敏度可提高从更高容量的血浆,如500毫升提取的RNA。等离子体可以centrifuged在21000×g离心90分钟,在进行所描述的那样的QIAamp病毒RNA提取试剂盒小型的协议之前以浓缩的病毒颗粒。
如图所示,该新方法具有它产生对个体患者的管理的综合报告一个附加的优点。这些报告是一个整合的基因型,免疫学和病毒学监测数据以及临床和治疗史从RegaDB。这是伴随着电阻档的详细解释化验后病人的临床病史同样详细的审查,以及治疗建议。使用一个专科医师审阅报告及患者提供治疗建议提供了急需的导师为执业护士以及临床医生经验不足,谁正越来越多地提供抗逆转录南非作为对任务转变世界卫生组织建议的一部分。这些临床报告已经证明是有效的教具为临床医生提供在药物抗性管理很少或没有经验。从患者的角度来看,我们的方法减少了前往中央网站访问专科艾滋病毒服务。
因此,作为一个整体所描述的协议提供了一个很好的平台,让艾滋病病毒耐药性的管理可以整合,以低廉的成本,为照顾爱滋病病毒感染人士未能艺术的统一体。可用于流行病学目的所产生的数据,以评估药物抗性,在社会的发展和传播。产生的POL片段的大小是比较复杂的系统发育分析,将产生更好的了解疫情在居群水平不够好。
The authors have nothing to disclose.
作者要感谢谁做这项工作可能所有的同事,尤其是玛雅人Balamane,伊丽莎白·约翰斯顿白,沙龙Sjoblom,格雷格 – 奥尔丁Zakhona Gumede,Xolile Kineri,Phindile Mabaso,Lungisa Ndwandwe,詹姆斯·加维,加文·科布,铣三Maphanga,Terusha切提,Kevi奈杜,安德鲁Skingsley,凯瑟琳·斯托特和Lungani Ndwandwe。作者还要感谢卫生署和谁工作赫拉比撒艾滋病治疗和护理方案非洲中心人员的全体人员。
Superscript III 1st strand Synthesis kit | Life Technologies | 18080051 | Reverse Transcription |
SATURN/LiFE Technologies Custom Primers | Life Technologies | 4473517 | PCR |
Platinum Taq | Life Technologies | 10966026 | PCR |
PureLink QUICK PCR Purification Kit | Life Technologies | K310002 | PCR |
Viroseq | ABBOTT | 4J94-20 | Reverse Transcription and PCR |
Agarose Tablets (Dnase/Rnase free) | BIOLINE | BIO-41027 | PCR |
TBE Buffer | MERCK | 1.06177.2500 | PCR |
O'Range Ruler 200bp DNA Ladder | Fermentas | FE SM0633 | PCR |
Novel Juice | GeneDireX | LD001-1000 | PCR |
MiniBis Bioimaging System | DNR Bioimaging Systems Ltd | Gel Documentation | |
Power Pac 300 | BIORAD | Gel Electrophoresis | |
Big Dye Terminator Kit ver 3.1 | Life Technologies | 4337456 | Sequencing |
Arrays | Life Technolgies | 4319899 | Sequencing |
PoP | Life technologies | 4363785 | Sequencing |
10 x EDTA Buffer | Life Technologies | 402824 | Sequencing |
Formamide | Life Technologies | 4311320 | Sequencing |
5 x Sequencing Buffer | Life Tecgnologies | 4336697 | Sequencing |
3130 xl Genetic Analyzer | Life Technologies | Sequencing | |
GeneAmp PCR System 9700 | Life Technologies | RT/PCR/Sequencing | |
Centrifuge 5804 | EPPENDORF | Sample Processing | |
Centrifuge 5415R | EPPENDORF | RNA Extraction | |
Centrifuge 5415R | EPPENDORF | RT and PCR | |
Centrifuge 5415D | EPPENDORF | PCR Product Clean up | |
Centrifuge 5810 | EPPENDORF | Sequencing Clean up | |
Picofuge | BIORAD | C1301-230V | RT and PCR |
Vortex Genius 3 | IKA | RNA Extraction | |
Vortex Genius 3 | IKA | reagent preparation | |
Vortex mixer | IKA | Sequencing Clean up | |
NanoDrop 2000 UV/VIS spectrophotometer | ThermoScientific | DNA quantification | |
3M Sodium Acetate | MERCK | 567422 | Sequencing Clean up |
Absolute Ethanol | MERCK | SAAR2233540LP | Sequencing Clean up |
1.5ml SARSTEDT Tubes | BIODEX | 72.692.005 | RNA Extraction |
2ml SARSTEDT Tubes | BIODEX | 72.693.005 | RNA Extraction |
2ml Collection tubes | SCIENTIFIC GROUP | MCT-200-NC/S | RNA Extraction |
Optical MicroAmp 96 Well reaction plates | Life Technologies | N8010560 | Sequencing |
200ul 8 Strip StarPCR Tubes with attached flat caps | STAR Lab – supplied by CELTIC | A1402-3700 | RT and PCR |
200ul PCR individual tubes | Scientific Group | CR/3745 | RT and PCR |
Geneious | Biomatters | Sequence analysis | |
Internet Access | Preferrably high speed | ||
Web resources | |||
hivdb.stanford.edu | Stanford University | Drug reistance analysis | |
http://bioafrica.mrc.ac.za:8080/regadb-ui/RegaDB | SATuRN | database | |
http://bioafrica.mrc.ac.za/tools/pppweb.html | SATuRN | Sequence quality tool |