抗レトロウイルス療法(ART)を失敗して、HIV-1感染者のための薬剤耐性検査は、将来の治療法を導き、治療成績を向上させることができます。高いHIV感染率が、リソースが制限された設定の最適化、個々の人口健康の結果は、最終的には手頃な価格でアクセス可能な薬剤耐性遺伝子型解析と解釈の方法が必要になります。
HIV-1薬剤耐性は真剣に抗レトロウイルス療法(ART)の有効性および耐衝撃性を損なう可能性を秘めている。サハラ以南のアフリカのアートプログラムは拡大を続けているため、ARTを個人が密接に薬剤耐性の出現を監視する必要があります。 ARTにすでに耐性ウイルス株の伝播を追跡するため送信された薬剤耐性の監視も重要である。ジェノタイピングは高価であり、洗練された実験室およびデータ管理インフラストラクチャを必要とするため、残念ながら、薬剤耐性検査は、まだ限られたリソースの設定中に容易にアクセスすることはできません。個人を管理し、送信された薬剤耐性を評価するためのオープンアクセスの遺伝子型薬剤耐性監視方法について説明する。この方法は、薬剤耐性パターンの解釈と個々の患者のレポートの生成のための無料のオープンソースソフトウェアを使用しています。遺伝子型決定プロトコルはavを有する血漿サンプルについて、95%以上の増幅率を有しているIRALロード>千のHIV-1 RNAコピー/ mlである。感度は、ウイルス負荷<千HIV-1 RNAコピー/ mlのために著しく低下する。ここで説明する方法は、米国食品医薬品局(FDA)、Viroseqジェノタイピング法によって承認されたテスト結果にHIV-1薬剤耐性の方法と比較して検証した。ここで説明する方法の限界は、それが自動化され、それは同じパネルからサブタイプAおよびBを増幅したものの、それはまた、サンプルの検証パネルからの循環組換え型のCRF02_AGを増幅するのに失敗したことがないという事実が挙げられる。
南部アフリカにおけるHIVの流行は、特に南アフリカ2、3に、抗レトロウイルス療法(ART)を個人の付随指数関数的な増加と共に急速に1を進化されています。発症4を削減し、資源の限られた設定で、平均寿命(RLS)を5増加させるのに大規模な治療プログラムの疫学的影響に関するエビデンスとして蓄積し続け、ARTのカバレッジを向上させる努力が強化されます。テスト対象の予防ツール6、7のような処理の使用に向けたガイドラインの進化とプログラムを扱うには、治療上の個人の絶対数がさらに増加することを意味します。 ARTを個人の平均寿命は、HIV感染していない人口8のそれに近づくように多数の個体は、より長期間の技術になります。 HIVの薬剤耐性の発生および伝達がALWAを有するYS ART 9月12日の業績への脅威と考えられて。したがって、より多くの個人がARTに開始される、より厳格な監視と薬剤耐性の監視が必要とされている。
遺伝子型薬剤耐性(GRT)試験は、監視のためだけでなく、ARTを受ける個体におけるHIV-1薬剤耐性の両方の監視、先進国で成功裏に使用されている。これらの設定では、GRTは、HIV-1感染者のケアの連続体に統合されました。ほとんどの国際ガイドラインはレジメン小児患者は、母子感染(PMTCT)の防止にさらされ、大人やアート(第一ラインと第2ラインの)13〜15を失敗小児患者のためにGRTをお勧めしますが、その後16を感染させ、との設定で急性感染した個体間で送信される13-15薬剤耐性の高レベル。しかし、コスト、技術、およびインフラストラクチャの要件は、インプリメンが限られているRLSにおける薬剤耐性のモニタリングと同様のアプローチテーション。
南アフリカHIV治療とモニタリングのガイドラインは、現在のファーストラインは17をレジメン失敗個人のARTの選択を導くのにGRTを使用することをお勧めしません。個人は、主にウイルス学(HIV-1 RNAウイルス量)のパラメータに基づいて切り替えられる。しかし2012年に、南部アフリカのHIV臨床医協会は、第一南部アフリカARV薬剤耐性検査の指針18を発表した。これらのガイドラインは、第一ラインと第2ラインのアートを失敗し、すべての大人のためとPMTCT 18にさらされ、感染した幼児や子供のためにGRT検査をお勧めします。アフリカ南部19-29の透過薬剤耐性の高いレベルには現在の証拠がないので、GRTは、急性感染者のための18をお勧めしません。それは、これらの勧告のいくつかは、国家TREに時間をかけて統合されることが期待される地域の様々な国のガイドラインをatmentおよび監視。すでに、2013年南アフリカの治療ガイドラインに大人のためのセカンドラインに障害が発生した時には、子どもたち30の第一選択または第二選択のPIベースのレジメンの失敗時のGRTの勧告は今そこにある。
それは南アフリカの治療ガイドラインにGRTを組み込むことは、潜在的にコスト中立的になることが示されている。真の二次治療に切り替えられる必要がある患者を同定するGRTを用いて、比較的より高価な第一選択薬よりもセカンドラインレジメン薬のコストを考慮すると、プログラムに追加のコストを生じない。また、GRTも、失敗の他の理由を特定し、治療の選択肢を節約し、新たな耐性パターン31についての情報を生成することができます。したがって、さらに、アクセス、ANケアの質を向上させるために、薬剤耐性の監視方法のコストを低減することが必要であるDの成果。
ここでは、逆転写、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)および配列決定した( 表1)、ならびに薬剤耐性の解釈のために主にオープンソースソフトウェアのための一般的な(オープンソースの)プライマーを使用するように設計GRT法を提案する。臨床管理のために、プロトコルは、国の治療ガイドラインに密着した研究室で薬剤耐性のレポートの専門家の解釈を包括的レビューおよび報告の方法によって補完されている。プロトコルは、4つの異なる成分に分割され、1)HIVリボ核酸(RNA)の抽出、2)逆転写およびポリメラーゼ連鎖反応(PCR)は、ウイルス標的の増幅、3)配列決定クロマトグラム、アラインメントの分析のため4)バイオインフォマティクス法キュレーションとシーケンスデータの解釈。
いくつかの低コストのインハウスの方法は、33、34、36 HIV薬剤耐性遺伝子型決定は、より手頃な価格で提供しようとする努力に記載されている。資源が限られた設定で、抗レトロウイルス療法を受けている人々のためのケアの連続に薬剤耐性検査を統合する必要性に疑問の余地はない。しかし、報告された方法のほとんどは、集団レベルでの薬剤耐性のサーベイランスにおける薬剤耐性遺伝子型決定の適用に焦点を当てる。土星/ライフテクノロジーズの遺伝子型判定法は、薬剤耐性のサーベイランス及びモニタリングのための完全に統合されたプロトコルです。この方法は、臨床管理のための報告書の薬剤耐性と世代の解釈の大部分はオープンソースとオープンアクセスのバイオインフォマティクスのリソースを実装する手頃なプロトコルとして設計されました。
これは、ようにするViroseq遺伝子型判定法を承認したFDAとの比較により示された正常に増幅された実験室用パネルサンプルの100%において、ANRS技能試験試料のパネルからの薬剤耐性変異の同定に正確。精度もサブタイプCウイルス、南部アフリカで最も優勢なサブタイプの臨床サンプルを評価した。それは本方法はCRF02_AGが流行している世界の他の部分で使用される場合は、方法日時プライマーの改変が必要であるサブタイプAおよびBにあったような方法は、サブタイプCサンプル上で正確であったCRF02_AGを有することが示されたパネル試料の一つを増幅するのに失敗しました。あるいは、すべての基Mに感受性のプライマーの縮重セットは、サブタイプの分布が38より不均一である場合は、領域36で使用することができる、33ウイルス。
逆転写およびPCRの感度は、例えば、500ミリリットル、プラズマの高いボリュームからRNAを抽出することにより増加させることができる。プラズマはcentrifすることができますをQIAampウイルスRNA抽出ミニキットに記載されているように、プロトコルを実行する前に、ウイルス粒子を濃縮するために90分間21000×gでuged。
図示のように、新しい方法は、個々の患者管理のための包括的なレポートを生成する追加の利点を有する。これらのレポートは、RegaDBから遺伝子型の統合、免疫学的およびウイルス学的監視データだけでなく、臨床および治療の歴史である。これは、同じように、詳細な患者の病歴の見直しだけでなく、治療勧告が続く抵抗プロファイルの詳細な実験室での解釈を伴う。レポートを確認し、患者のための治療勧告を提供するために、専門の医師の使用はますますタスクシフティングのためのWHOの勧告の一部として南アフリカでARTを提供している看護実践だけでなく、経験の浅い臨床医のための待望の指導を提供します。これらの臨床レポートには、薬剤耐性管理のほとんど、またはまったく経験の臨床医のための効果的な教材であることが示されている。患者の視点から、私たちの方法は、専門家のHIVサービスにアクセスするために、集中サイトに移動する必要がなくなります。
このように、全体として説明されたプロトコルは、HIVの薬剤耐性管理がARTを失敗、HIV感染者のケアの連続に、低コストで、統合することができるような優れたプラットフォームを提供します。生成されたデータは、コミュニティ内の薬剤耐性の発生および送信を評価するために、疫学的目的に使用することができる。生成されたPOL断片の大きさは、集団レベルでの流行のよりよい理解を生成し、より複雑な系統解析には十分である。
The authors have nothing to disclose.
著者らは、この作業を可能にしたすべての同僚、特にマヤBalamane、エリザベス·ジョンストンホワイト、シャロンSjoblom、グレッグディングZakhona Gumede、Xolile Kineri、Phindile Mabaso、Lungisa Ndwandwe、ジェームズ·ガーベイ、ギャビンコブ、Senzo Maphanga、Terusha Chettyを承認したいと思います、Keviナイドウ、アンドリューSkingsley、キャサリン·ストット、およびLungani Ndwandwe。著者はまたHlabisa、HIV治療とケアプログラムを働く保健省とアフリカセンター職員のすべての職員に感謝したいと思います。
Superscript III 1st strand Synthesis kit | Life Technologies | 18080051 | Reverse Transcription |
SATURN/LiFE Technologies Custom Primers | Life Technologies | 4473517 | PCR |
Platinum Taq | Life Technologies | 10966026 | PCR |
PureLink QUICK PCR Purification Kit | Life Technologies | K310002 | PCR |
Viroseq | ABBOTT | 4J94-20 | Reverse Transcription and PCR |
Agarose Tablets (Dnase/Rnase free) | BIOLINE | BIO-41027 | PCR |
TBE Buffer | MERCK | 1.06177.2500 | PCR |
O'Range Ruler 200bp DNA Ladder | Fermentas | FE SM0633 | PCR |
Novel Juice | GeneDireX | LD001-1000 | PCR |
MiniBis Bioimaging System | DNR Bioimaging Systems Ltd | Gel Documentation | |
Power Pac 300 | BIORAD | Gel Electrophoresis | |
Big Dye Terminator Kit ver 3.1 | Life Technologies | 4337456 | Sequencing |
Arrays | Life Technolgies | 4319899 | Sequencing |
PoP | Life technologies | 4363785 | Sequencing |
10 x EDTA Buffer | Life Technologies | 402824 | Sequencing |
Formamide | Life Technologies | 4311320 | Sequencing |
5 x Sequencing Buffer | Life Tecgnologies | 4336697 | Sequencing |
3130 xl Genetic Analyzer | Life Technologies | Sequencing | |
GeneAmp PCR System 9700 | Life Technologies | RT/PCR/Sequencing | |
Centrifuge 5804 | EPPENDORF | Sample Processing | |
Centrifuge 5415R | EPPENDORF | RNA Extraction | |
Centrifuge 5415R | EPPENDORF | RT and PCR | |
Centrifuge 5415D | EPPENDORF | PCR Product Clean up | |
Centrifuge 5810 | EPPENDORF | Sequencing Clean up | |
Picofuge | BIORAD | C1301-230V | RT and PCR |
Vortex Genius 3 | IKA | RNA Extraction | |
Vortex Genius 3 | IKA | reagent preparation | |
Vortex mixer | IKA | Sequencing Clean up | |
NanoDrop 2000 UV/VIS spectrophotometer | ThermoScientific | DNA quantification | |
3M Sodium Acetate | MERCK | 567422 | Sequencing Clean up |
Absolute Ethanol | MERCK | SAAR2233540LP | Sequencing Clean up |
1.5ml SARSTEDT Tubes | BIODEX | 72.692.005 | RNA Extraction |
2ml SARSTEDT Tubes | BIODEX | 72.693.005 | RNA Extraction |
2ml Collection tubes | SCIENTIFIC GROUP | MCT-200-NC/S | RNA Extraction |
Optical MicroAmp 96 Well reaction plates | Life Technologies | N8010560 | Sequencing |
200ul 8 Strip StarPCR Tubes with attached flat caps | STAR Lab – supplied by CELTIC | A1402-3700 | RT and PCR |
200ul PCR individual tubes | Scientific Group | CR/3745 | RT and PCR |
Geneious | Biomatters | Sequence analysis | |
Internet Access | Preferrably high speed | ||
Web resources | |||
hivdb.stanford.edu | Stanford University | Drug reistance analysis | |
http://bioafrica.mrc.ac.za:8080/regadb-ui/RegaDB | SATuRN | database | |
http://bioafrica.mrc.ac.za/tools/pppweb.html | SATuRN | Sequence quality tool |