منظمة حلزونية من الدم التخثر عامل الثامن على الدهون الأنابيب النانومترية
Summary
نقدم مجموعة من المجهر البرد الإلكترون، والدهون تكنولوجيا النانو، وتحليل بنية تطبيقها لحل هيكل غشاء محدد من شكلين FVIII مثلي للغاية: الإنسان والخنازير. يوصف المنهجية التي وضعت في المختبر لدينا لتنظيم حلزوني وهما وظيفية أشكال FVIII المؤتلف على الأنابيب النانوية الدهون سالبة الشحنة (LNT).
Abstract
البرد المجهر الإلكتروني (البرد EM) 1 هو نهج قوية للتحقيق في الهيكل الوظيفي للبروتينات والمجمعات في حالة وغشاء البيئة المائية 2.
تخثر العامل الثامن (FVIII) 3 هو متعدد المجال بروتين سكري بلازما الدم. عيب أو نقص FVIII هو سبب لنوع الهيموفيليا A – اضطراب نزيف حاد. عند تنشيط بروتين، FVIII بربط البروتيني سيرين عامل IXA على غشاء الصفيحات المشحونة سلبا، وهو أمر حاسم لتخثر الدم الطبيعي 4. على الرغم من الدور المحوري يلعب FVIII في تجلط الدم، المعلومات الهيكلية للدولة ملزمة لها غشاء غير مكتملة 5. التركيز FVIII المؤتلف هو الدواء الأكثر فعالية ضد نوع الهيموفيليا A ويمكن التعبير المتاحة تجاريا على حد سواء FVIII تشكيل المجمعات وظيفية مع الإنسان عامل IXA 6،7 الإنسان أو الخنزير.
"> في هذه الدراسة نقدم مجموعة من المجهر البرد الإلكترون (البرد EM)، تطبيق تكنولوجيا النانو الدهون وهيكل تحليل لحل هيكل غشاء محدد من شكلين FVIII مثلي للغاية: الإنسان والخنازير والمنهجية التي وضعت في المختبر لدينا لتنظيم حلزوني وهما وظيفية أشكال FVIII المؤتلف على الأنابيب النانوية الدهون سالبة الشحنة (LNT) يوصف. توضح النتائج أن ممثل نهجنا هو حساسة بما فيه الكفاية لتحديد الاختلافات في تنظيم حلزونية بين اثنين غاية مثلي في تسلسل (تسلسل 86٪ الهوية وترد) البروتينات. بروتوكولات تفصيلية لتنظيم حلزونية، البرد EM والإلكترون التصوير المقطعي (ET) الحصول على البيانات. وثنائي الأبعاد (2D) وتطبيق ثلاثي الأبعاد (3D) تحليل هيكل للحصول على اعادة البناء 3D من الإنسان والخنزير ويناقش FVIII-LNT. تظهر الهياكل FVIII-LNT الإنسان والخنازير قدم المحتملة للمنهجية المقترحة لcalculatه لمنظمة غشاء محدد وظيفية من عامل تخثر الدم الثامن في ارتفاع القرار.Introduction
عامل تخثر الدم الثامن (FVIII) هو بروتين سكري كبيرة من الأحماض الأمينية 2،332 نظمت في ستة مجالات: A1-A2-B-A3-C1-C2 3. على الثرومبين تفعيل FVIII بدور العامل المساعد للعامل IXA داخل مجمع Tenase غشاء محدد. ملزمة من FVIII المنشط (FVIIIa) لFIXA بطريقة اعتمادا غشاء يعزز كفاءة FIXA بروتين أكثر من 10 5 مرات، وهو أمر حاسم لكفاءة تخثر الدم 4. على الرغم من الدور المهم الذي يلعبه في FVIII تخثر وتشكيل Tenase المعقدة، وغشاء محدد وظيفية هيكل FVIII هو لم تحل بعد.
لمعالجة ذلك، واحد الأنابيب النانوية الدهون طبقة ثنائية (LNT) الغنية في فسفاتيديل (PS)، وقادرة على FVIII ملزم مع تقارب عالية 8 و 9 و تشبه سطح الصفائح الدموية تنشيط وضعت 10. وقد ثبت منظمة حلزونية متتالية من FVIII بد أن LNT أن يكون effectiلقد لتحديد هيكل FVIII غشاء محدد من قبل الدولة البرد EM 5. بين functionalized LNT هي النظام المثالي لدراسة البروتين البروتين التفاعلات والبروتين غشاء من البروتينات المرتبطة غشاء حلزوني نظمت من قبل البرد EM 11، 12. البرد EM لديه ميزة على الطرق الهيكلية التقليدية مثل البلورات بالأشعة السينية والرنين المغناطيسي النووي، كما يتم الاحتفاظ العينة في الأقرب إلى البيئة الفسيولوجية (العازلة، غشاء، ودرجة الحموضة)، من دون إضافات والنظائر. في حالة FVIII، ودراسة هيكل غشاء محدد مع هذا الأسلوب هو أكثر أهمية من الناحية الفسيولوجية، كما LNT تشبه من حيث الحجم والشكل وتكوين أقدام كاذبة من الصفائح الدموية تفعيلها حيث تجميع المجمعات Tenase في الجسم الحي.
عيوب ونقص FVIII سبب الهيموفيليا A، اضطراب النزيف الحاد التي تؤثر على 1 في 5،000 الذكور من السكان الإنسان 4، 6. الأكثر البريدالعلاج ffective عن الهيموفيليا (أ) هو الإدارة مدى الحياة من الإنسان FVIII المؤتلف (hFVIII). ومن المضاعفات كبيرة من المؤتلف FVIII الهيموفيليا والعلاج هو تطوير الأجسام المضادة المثبطة لشكل الإنسان التي تؤثر على ما يقرب من 30٪ من مرضى الهيموفيليا A 13. في هذه الحالة، يتم استخدام FVIII الخنازير (pFVIII) التركيز، كما يعرض FVIII الخنازير منخفضة عبر التفاعل مع الأجسام المضادة المثبطة ضد FVIII الإنسان وأشكال المجمعات وظيفية مع FIXA الإنسان 7. إنشاء المنظمة غشاء محدد من كل من الخنازير وأشكال FVIII الإنسان المهم أن نفهم أساس الهيكلية للFVIII ظيفة العامل المساعد وآثارها على الإرقاء الدم.
في هذه الدراسة، ونحن تصف مزيج من تكنولوجيا النانو الدهون، البرد EM، وتحليل بنية تهدف إلى حل المنظمة غشاء محدد من شكلين FVIII مثلي للغاية. البيانات البرد EM وهياكل 3D المقدمة للporci نظمت حلزونيFVIII شمال شرق والبشرية المشحونة سلبا على LNT تظهر إمكانات تكنولوجيا النانو المقترحة كأساس لتحديد هيكل FVIII وعوامل التخثر غشاء محدد والمجمعات في بيئة غشاء الفسيولوجية.
Protocol
Representative Results
Discussion
في هذا العمل ويقدم منهجية للتمييز بين اثنين غشاء محدد المنظمات البروتينات مثلي للغاية: FVIII الإنسان والخنازير على الأنابيب النانوية الدهون في الظروف التي واجهتها في الجسم البشري الذاتي تجميعها.
<p class="jove_content" style=";text-align:right;direction:r…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ويدعم هذا العمل من خلال منحة تنمية ساينتست الوطني من جمعية القلب الأمريكية: 10SDG3500034 وUTMB-الأهلي بدء الأموال إلى SSM. يعترف الكتاب المرافق البرد EM والحوسبة العلمية في مركز سيلي لعلم الأحياء الهيكلي في UTMB ( www.scsb.utmb.edu )، وكذلك الدكاترة. ستيف ووتك إد Egelman للمساعدة في الخوارزميات إعادة الإعمار حلزونية 2D و 3D.
Materials
| JEM2100 with LaB6 | JEOL Ltd. | JEM-2100 | operated at 200 kV |
| with TEMCON software | JEOL Ltd. | ||
| Gatan626 Cryo-holder | Gatan, Inc. | 626.DH | cooled to -175 °C |
| with temperature controler unit | Gatan, Inc. | ||
| Gatan 4K x 4K CCD camera | Gatan, Inc. | US4000 | 4096 x 4096 pixel at 15 microns/pixel physical resolution |
| Solarus Model 950 plasma cleaner | Gatan, Inc. | ||
| Vitrobot Mark IV | FEI | ||
| Materials | |||
| Carbon coated 300 mesh 3mm copper grid | Ted Pella | 01821 | plasma cleaned for 10 s on high power |
| Quantifoil R2/2 300 mesh | Electron Microscopy Sciences | Q225-CR2 | Carbon coated 300 mesh Cu grids with 2 mm in diameters holes |
| Uranyl acetate dihydrate | Ted Pella | 19481 | 1% solution, filtered |
| Galactosyl ceramide | Avanti Polar Lipids Inc. | 860546 | |
| Dioleoyl-sn-glycero-phospho-L-serine | Avanti Polar Lipids Inc. | 840035 | |
| Software | |||
| EM software Digital Micrograph | Gatan, Inc. | http://www.gatan.com/DM/ | |
| EM software EMAN | free download | http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN/ | |
| EM software Spider | free download | http://spider.wadsworth.org/spider_doc/spider/docs/spider.html | |
| EM software IHRSR | free download | Programs available from Edward H. Egelman http://people.virginia.edu/~ehe2n/ | |
| EM software (IMOD) | free download | http://bio3d.colorado.edu/imod/ | |
| EM software (SerialEM) | free download | ftp://bio3d.colorado.edu/pub/SerialEM/ | |
| UCSF-Chimera | free download | http://www.cgl.ucsf.edu/chimera/download.html |
References
- Henderson, R. Realizing the potential of electron cryo-microscopy. Quarterly Reviews of Biophysics. 37, 3-13 (2004).
- Fujiyoshi, Y., Unwin, N. Electron crystallography of proteins in membranes. Current opinion in structural biology. 18, 587-592 (2008).
- Toole, J. J., et al. Molecular cloning of a cDNA encoding human antihaemophilic factor. Nature. 312, 342-347 (1984).
- Fay, P. J. Factor VIII structure and function. International journal of hematology. 83, 103-108 (2006).
- Stoilova-McPhie, S., Lynch, G. C., Ludtke, S. J., Pettitt, B. M. Domain organization of membrane-bound factor VIII. Biopolymers. , (2013).
- Pipe, S. W. Hemophilia: new protein therapeutics. Hematology / the Education Program of the American Society of Hematology. American Society of Hematology. Education Program. 2010, 203-209 (2010).
- Gatti, L., Mannucci, P. M. Use of porcine factor VIII in the management of seventeen patients with factor VIII antibodies. Thrombosis and haemostasis. 51, 379-384 (1984).
- Parmenter, C. D., Cane, M. C., Zhang, R., Stoilova-McPhie, S. Cryo-electron microscopy of coagulation Factor VIII bound to lipid nanotubes. Biochemical and biophysical research communications. 366, 288-293 (2008).
- Parmenter, C. D., Stoilova-McPhie, S. Binding of recombinant human coagulation factor VIII to lipid nanotubes. FEBS letters. 582, 1657-1660 (2008).
- Wassermann, G. E., Olivera-Severo, D., Uberti, A. F., Carlini, C. R. Helicobacter pylori urease activates blood platelets through a lipoxygenase-mediated pathway. Journal of cellular and molecular medicine. 14, 2025-2034 (2010).
- Wilson-Kubalek, E. M., Chappie, J. S., Arthur, C. P. Helical crystallization of soluble and membrane binding proteins. Methods in enzymology. 481, 45-62 (2010).
- Egelman, E. H. Reconstruction of helical filaments and tubes. Methods in enzymology. 482, 167-183 (2010).
- Lusher, J. M. Development and introduction of recombinant factor VIII–a clinician’s experience. Haemophilia : the official journal of the World Federation of Hemophilia. 18, 483-486 (2012).
- Thim, L., et al. Purification and characterization of a new recombinant factor VIII (N8). Haemophilia : the official journal of the World Federation of Hemophilia. 16, 349-359 (2010).
- Doering, C. B., Healey, J. F., Parker, E. T., Barrow, R. T., Lollar, P. High level expression of recombinant porcine coagulation factor VIII. The Journal of biological chemistry. 277, 38345-38349 (2002).
- Tang, G., et al. EMAN2: an extensible image processing suite for electron microscopy. Journal of structural biology. 157, 38-46 (2007).
- Egelman, E. H. A robust algorithm for the reconstruction of helical filaments using single-particle methods. Ultramicroscopy. 85, 225-234 (2000).
- Egelman, E. H. The iterative helical real space reconstruction method: surmounting the problems posed by real polymers. Journal of structural biology. 157, 83-94 (2007).
- Mastronarde, D. N. Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements. Journal of structural biology. 152, 36-51 (2005).
- Stoilova-McPhie, S., Villoutreix, B. O., Mertens, K., Kemball-Cook, G., Holzenburg, A. 3-Dimensional structure of membrane-bound coagulation factor VIII: modeling of the factor VIII heterodimer within a 3-dimensional density map derived by electron crystallography. Blood. 99, 1215-1223 (2002).
- Goddard, T. D., Huang, C. C., Ferrin, T. E. Visualizing density maps with UCSF Chimera. Journal of structural biology. 157, 281-287 (2007).
